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導讀：2022年9月5日，英國倫敦大學Marco P. C. Marques[1]作為通訊作者，在Biotechnol Bioeng發(fā)表文章《Maximizing mRNA vaccine production with Bayesian optimization》。該文章介紹了一種機器學習方法——Bayesian優(yōu)化，其作為實驗設計（DoE）的一種形式可以將mRNA產量提高兩倍。在這項研究中，Bayesian優(yōu)化僅在60次實驗運行中發(fā)現(xiàn)了最佳反應條件，產生12 g·L?1?mRNA只需2小時。

由于近年來mRNA疫苗技術的興起，人們對在診斷和治療應用中使用mRNA疫苗的興趣日益濃厚。mRNA疫苗是在由RNA聚合酶催化的體外轉錄（IVT）中產生的，產量通常為2-5??g·L?1。由于高效且具有成本效益的生產工藝對于大規(guī)模生產和疫苗供應鏈至關重要，因此IVT反應條件優(yōu)化越來越重要。傳統(tǒng)的優(yōu)化方法依賴于經(jīng)典的DoE方法，這些方法非常耗時，并且可能呈現(xiàn)人為偏見或基于簡化的假設。本研究采用Bayesian優(yōu)化可實現(xiàn)實驗設計自動化，提供反饋循環(huán)。在60次運行中發(fā)現(xiàn)了最佳反應條件（在兩小時內產生12 g·L-1），優(yōu)于已公布的行業(yè)標準。這些結果增強了Bayesian優(yōu)化在工業(yè)應用中優(yōu)化生物化學反應的潛力。

Bayesian優(yōu)化

Bayesian優(yōu)化有兩個主要組成部分：代理模型和采集函數(shù)。代理模型模擬正在優(yōu)化的未知函數(shù)，同時在計算上進行評估。用每個新的測量值更新先驗分布，以產生更準確的后驗分布。采集函數(shù)基于代理模型的平均值（μ）和標準差（σ）。以下要評估的點由采集函數(shù)確定，例如可以計算當前最佳結果的最大預期改進（EI）。實驗設計挑戰(zhàn)并非mRNA生產所獨有，尤其是IVT反應。設計問題在科學和工業(yè)環(huán)境中都普遍存在。Bayesian優(yōu)化的出現(xiàn)為合成化學或機器學習等領域的各種設計問題提供了強大的方法論。

IVT優(yōu)化工作流程

簡而言之，在IVT反應中，RNA聚合酶以DNA模板、核苷三磷酸（NTP）為底物合成互補RNA分子。在這項研究中，確定了12個可能影響反應結果的反應參數(shù)：酶活性（T7 RNA聚合酶和無機磷酸酶）；核糖核酸酶抑制劑、DNA模板、NTP、亞精胺和二硫蘇糖醇（DTT）的濃度；輔助因子的類型及其濃度（例如醋酸鎂與氯化鎂）；反應pH、溫度和反應時間（表1）。反應和工藝參數(shù)匯總見表1。表1 IVT參數(shù)和評價指標

將模型建議的每次實驗運行中獲得的mRNA濃度輸入Bayesian優(yōu)化器，初始反應條件隨機化。在每個實施的優(yōu)化周期中，根據(jù)過程的模型知識（即要產生的最大量mRNA）更新模型并提出新的實驗條件（圖1a）。具體優(yōu)化流程按如下方式進行：

1.使用協(xié)方差函數(shù)初始化高斯過程（GP）代理模型。

2.為代理模型選擇一批隨機初始反應條件，這些條件取自拉丁超立方抽樣（LHS）設計。

3.進行初始實驗，并分析mRNA產量。

4.使用經(jīng)過評估的mRNA反應條件模型，構建后驗分布。

5.基于代理模型計算、獲取函數(shù)及其最大值，用于優(yōu)化后續(xù)反應條件（圖1b）。

6.?重復步驟4和5，直到滿足選定的收斂標準。

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優(yōu)化分析

可以通過多種方式跟蹤優(yōu)化過程的進度。可以借助平行坐標圖對反應參數(shù)空間進行探索（圖1c）。該圖概述了整個優(yōu)化過程中可能的最佳反應參數(shù)范圍。隨著時間的推移，還會評估最佳反應條件，用于確定優(yōu)化周期中是否取得了重大進展。通過分析整個優(yōu)化實驗的平行坐標圖，可以觀察到當醋酸鎂濃度在40-70 mM之間，NTPs濃度在7 mM以上，亞精胺濃度在1-3 mM，T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）的體積活性在6000-8000?U·mL?1，反應溫度在37-45°C，初始pH值低于7.5時，可獲得最佳mRNA產量。在優(yōu)化程序的前60次運行中發(fā)現(xiàn)了產生最大量mRNA的反應條件（圖1d）。獲得的幾種反應條件，產量均超過10 g?mRNA· L?1。

為了更好地理解IVT反應條件優(yōu)化，本研究使用了兩種不同的機制。首先，將預期mRNA IVT產量和模型預測與反應經(jīng)驗評估進行比較。其次，為GP代理模型構建了解釋模型（圖1e，f）。結合這些機制對坐標圖進行評估，可以推斷特定參數(shù)對代理模型預測的影響。pH值對反應結果有很高的影響（積極的），特別是在6.5-7.5之間。其次是輔因子濃度，最佳范圍設置在40-60 mM 之間。高無機焦磷酸酶和DTT濃度對反應產生積極影響。對于較高濃度的DNA和NTPs（分別高于40 nM和7 mM），也觀察到這一點。T7 RNAP的存在會影響模型，但在較低的酶體積活性下，在6000和8000 U·mL?1之間，最終將產生更多的mRNA。令人驚訝的是，高亞精胺濃度會對模型產生負面影響，最佳值在1-3 mM范圍內（圖1c，e，f）。

IVT動力學

在進行的實驗中，反應時間沒有明確優(yōu)化。然而，根據(jù)反應曲線評估了超過10.7 g?mRNA·L?1的六種最佳反應條件（表2）。將這些反應與Moderna專利中列出的反應參數(shù)相對應的基準反應條件進行了比較，這導致預期的mRNA產量為5 g ·L?1。表2 與基準反應條件（反應7）相比，Bayesian優(yōu)化后最佳反應條件下（反應1-6）的mRNA生產反應參數(shù)和mRNA濃度

為了獲得反應曲線，在5小時內取樣（圖2a）。優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)所有的反應都優(yōu)于基準反應，產生至少10 g?mRNA· L?1的mRNA。盡管在優(yōu)化運行期間，反應1和4產生的mRNA量最高，但反應5在2 時后在更短的時間內實現(xiàn)了最高的產量，對應于10.65 ± 0.01 g?mRNA· L?1的最終濃度（圖2b）。還通過瓊脂糖凝膠電泳（圖2c）和HPLC分析評估產生的mRNA質量。約115分鐘后，未檢測到mRNA量的顯著變化，確認反應性能在2小時標記處達到峰值。觀察到第二條帶在115分鐘后增加，這可能對應于反應副產物，例如雙鏈mRNA（dsmRNA）或異常mRNA。HPLC分析表明，在反應完成，dsRNA/RNA?total之比為0.05±0.0033 mg · mg?1。

IVT性能驗證

為了驗證優(yōu)化的反應性能，本研究比較了使用不同大小模板的mRNA產量。含有EGFP基因的模板，Covid-19受體結合結構融合到EGFP（RDB_EGFP），Cas9基因也融合到EGFP（Cas9_EGFP），分別為1195、1864和5299 bp。研究了反應曲線（圖2d）和2小時后產生的總mRNA濃度之間的差異（圖2e）。改變模板的大小不會對使用條件優(yōu)化的反應結果產生影響。所有評估的模板大小均產生超過10 g·L?1的mRNA。然而，對于較大的模板，mRNA濃度傾向于從9.7±0.29 g·L?1（反應時間145分鐘）降低到7.1±0.19?g·L?1（反應結束）。盡管濃度減少，在反應時間的2小時內仍然產生10 g?mRNA· L?1。

最佳IVT生產條件比較

將最高mRNA產生反應條件與文獻和專利中報道的不同反應條件進行比較（圖2f）。在反應時間的2小時內，獲得了12g?mRNA· L?1的總量，超過基準反應2倍（表2）。

總結

由于近年來mRNA疫苗技術的興起，IVT反應優(yōu)化變得越來越重要。然而，現(xiàn)有的優(yōu)化實驗集中在反應建模上或DoE方法論。優(yōu)化方法僅考慮對小參數(shù)空間的探索，并且通常假設反應參數(shù)之間的關系由預先建立的酶動力學模型給出。本研究證明了Bayesian優(yōu)化方法在應用于IVT生產mRNA時的有效性。IVT是一種依賴于12種不同反應參數(shù)的多組分反應。使用這種方法，僅在60次實驗運行中發(fā)現(xiàn)了mRNA的最佳生產條件。總體而言，通過使用Bayesian優(yōu)化能夠在不到兩小時將mRNA IVT產量提高兩倍，高達12 g?mRNA· L?1。事實證明，這種優(yōu)化方法具有成本效益，因為它只需要60個反應即可實現(xiàn)最佳參數(shù)組合。所獲得的結果有可能提高mRNA疫苗的全球生產能力并增強Bayesian優(yōu)化在工業(yè)應用中優(yōu)化生物化學反應的潛力。

參考文獻

[1] ROSA S S, NUNES D, ANTUNES L, et al. Maximizing mRNA vaccine production with Bayesian optimization [J]. Biotechnology and bioengineering, 2022, 119(11): 3127-39.