1 前言說明

本課題組的感受態(tài)質(zhì)粒來自公司，天根、全式金等。DH5α感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌DH5α菌株經(jīng)過處理得到的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。不同公司的操作流程可能存在些許差異，但大體上是不變的。

本實驗方案是收納及歸納個人在實驗過程中的執(zhí)行方案。

2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實驗

2.1實驗設(shè)備及材料信息

1.DH5α（一種常用于質(zhì)粒克隆的菌株）100ul;

2.目的DNA準(zhǔn)備：重組，酶連接，定點突變，普通DNA轉(zhuǎn)化等

3.制冰機(jī)提前打開、超凈工作臺提前30min紫外，

2.2實驗操作程序

E.coli DH5α Cells使用前在冰上融化（冰盒準(zhǔn)備），取用1管感受態(tài)細(xì)胞（以100ul為例）置于冰浴中。

輕彈混勻，分裝50ul到另一個1.5ml 離心管：轉(zhuǎn)化管和陰性對照管（microcentrifuge tubes)（忌劇烈振蕩混合細(xì)胞，防止破裂）

加入DNA樣品（吸取0.5ng-1ng）到轉(zhuǎn)化管，輕彈混勻（所用DNA體積不超過感受態(tài)細(xì)胞懸液的1/10）

冰中放置30min，期間將金屬浴鍋加熱至42℃（待用，熱激）

42℃放置60s-90s（不同試劑盒熱激時間有差異，注意）后立即轉(zhuǎn)入冰中放置2-3min（嚴(yán)格計時，及時轉(zhuǎn)入，不要搖晃離心管）

每管加LB培養(yǎng)基(L-broth）（預(yù)先在37℃保溫），至終體積為500ul（不含抗生素）

37℃搖床振蕩培養(yǎng)45-60min(200rpm)（目的是使質(zhì)粒相關(guān)抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇）

將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100ul已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加入到LB固體瓊脂培養(yǎng)基上（含相應(yīng)抗生素），用無菌的彎頭玻棒輕輕將細(xì)胞均勻涂開。（平板置于室溫直至液體被吸收）

倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16h（計算好時間，避免超過16h）

【克隆化培養(yǎng)（?。?/span>】挑出3-5個克隆，轉(zhuǎn)移到裝有2-3ml LB培養(yǎng)基（含抗生素）（根據(jù)細(xì)菌繁殖速度和所需密度）的搖菌管中培養(yǎng)12-16h

取0.2-1ml的菌液，送去測序。

【克隆化培養(yǎng)（擴(kuò)大）】一般情況，等測序結(jié)果，選擇正確目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后續(xù)的中提/大提。

【菌種保藏】中提培養(yǎng)在離心儲存前保留部分菌種，以1:1比例將500ul甘油和500ul菌液混合加入到離心管中，封口膜封閉，-80℃儲存。（無菌操作）