? ? 對于研究糖基化蛋白質組學的學者們來講，很多人喜歡用sweet這個詞來形容自己的研究課題。我個人也很喜歡這個單詞，這是一個讓人感到幸福而溫暖的詞語，會讓你對你的課題充滿了愛意。但回頭想想，當初懵懵懂懂讀到研究生，誤打誤撞進入蛋白質組學圈，好像也就是隨大流的主動抑或是被動選擇了博士階段的課題，期間有艱苦，有迷茫，也有收獲，有喜悅。話扯遠了，就讓我們進入今天的話題，談一談糖基化蛋白質組學發(fā)展到了今天，我們所能做的，和我們想要做的，希望能給領域內的研究者們帶來一點點的啟迪，也讓不熟悉這個領域的科研工作者們對糖基化蛋白質組有個粗略的印象。

? ? 在講糖基化蛋白質組之前，先提一下什么叫做蛋白質組?？赡軐τ诩幢闶遣欢蒲械睦习傩諄碚f，基因組已經(jīng)是耳熟能詳?shù)脑~匯了。但談到蛋白質組，好多人就懵圈了。用較為通俗易懂的話來說，蛋白質組是指一個細胞或者一種組織或者一類器官甚至是某一物種所表達的全部蛋白質。實際上，生物體內蛋白質組的表達是一個動態(tài)變化的過程，在這一瞬間和下一瞬間，都是不一樣的，也許是同一種蛋白質的表達量發(fā)生了變化，也許是其中所表達的蛋白質種類發(fā)生了變化。聽起來，這就很復雜了對不對？可是要知道，研究作為其中一個子集的糖基化蛋白質組，更是一件難上加難的事。為什么這么講？那就讓我們先來了解一下糖基化修飾是如何發(fā)生的。對于一個特定蛋白的表達，會經(jīng)歷從DNA到mRNA的轉錄、轉錄后加工、最后翻譯成蛋白質的一系列過程。而當?shù)鞍踪|被正確表達、剪切、折疊后，很多蛋白會進行一個我們叫做翻譯后修飾（post translational modification）的過程，而后才成為具有相應生理功能的成熟蛋白。這也就是我們?yōu)槭裁闯３ＵfOne Gene, Many Proteins的緣由。在真核生物體內已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的翻譯后修飾有好幾百種，其中研究得比較廣泛的應該是磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化、泛素化等。

? ?其中，糖基化修飾應該算得上是其中比較復雜的一種了，不像很多其他修飾可能只是在某一種或幾種氨基酸上的側鏈上增加一個共價結合的分子量固定的基團，糖基化修飾可能發(fā)生在天冬酰胺Asn的側鏈氨基（-NH2）上（符合N-X-S/T, X≠P的序列規(guī)律，稱為N-連接糖基化修飾）或者發(fā)生在絲氨酸Ser或者蘇氨酸Thr的側鏈羥基（-OH）上（稱為O-連接糖基化修飾），而每一個修飾位點的糖鏈可能存在多種不同的糖型（筆者按：以上為最主要的兩大類糖基化修飾類型，另外還有C-連接糖基化修飾、GPI錨定連接糖基化修飾等）。用直白一點的語言來說，就是每個可能發(fā)生糖基化修飾的位點（不論是哪種類型的糖基化修飾）都可能接上非常多不同種類的糖鏈（圖1列出了N-連接糖基化修飾的三大類——高甘露糖型high mannose、雜合型hybrid和復雜型complex以及最常見的四種O-連接糖基化修飾的核心結構——core 1, 2, 3, 4）。你可以想象，本來是一堆一模一樣的光禿禿的蛋白（當然這是種夸張的說法啦），在它們的第123位氨基酸上有個糖基化修飾位點，于是一堆同樣的蛋白根據(jù)所帶糖鏈結構的不同分成了好幾十堆，這一堆帶一種糖鏈，那一堆帶另一種糖鏈，以此類推……天啦嚕，想想就覺得很復雜很頭疼，對不對？

? ? 別急，你以為這就是坑了，那請你小心駕駛，前方有更大更深的坑呢。嗯，我還是試著用比較通俗一點的語言來闡述接下來的問題吧。還是老規(guī)矩，先給大家介紹一下經(jīng)典的蛋白質組學shotgun研究策略。如圖2所示，當我們從研究對象（細胞、組織、血液樣本等）中提取了全蛋白，通常會選用合適的酶（最常用的是胰酶trypsin或者Lys-C酶）將蛋白酶解成肽段，為了提高蛋白質組的覆蓋深度，可以先將肽段進行分級處理（也就是采用合適的色譜分離方法將一個樣品分成數(shù)十個餾分，當然你完全可以省略這一步），而后將得到的不同餾分或者整個肽段混合樣本進行RPLC-MS/MS分析（即反向分離后進行串級質譜鑒定），從而得到數(shù)十萬甚至上百萬張二級譜圖。將這些二級譜圖，與基于該物種基因組數(shù)據(jù)推導而來的蛋白質序列經(jīng)過模擬酶切（in silico digestion）后得到的理論譜圖進行比對，即可確定我們的研究樣本中究竟有哪些蛋白質存在。如果這個過程大家理解了，那么我想告訴大家的是，在某一個樣本中，必然同時存在含量高的蛋白和含量低的蛋白。含量高的蛋白我們通常稱其為高豐度蛋白，含量低的蛋白則為低豐度蛋白。前面說，蛋白質經(jīng)過糖基化修飾這一步，才會在其某些位點上帶上糖鏈。必須指出的是，雖然有很多蛋白都會發(fā)生糖基化修飾（在真核生物體內這個比例甚至可能高達50%），但發(fā)生糖基化修飾的蛋白質的含量是非常低的。也就是說，很多蛋白都發(fā)生了糖基化修飾，但對每個蛋白而言，只有極少一部分發(fā)生了糖基化修飾。最最關鍵的是，發(fā)生糖基化修飾的這部分蛋白又不是完全一樣的，有些帶上這一類糖鏈，有些又帶上那一類糖鏈。因此，當糖基化肽段和非糖基化肽段同時被離子化，而后進入質譜進行檢測時，必然是高豐度的非糖基化肽段被檢測到的可能性更高。如果質譜花了時間和精力在高豐度的肽段上，那么低豐度的肽段則會被妥妥忽略，更別提糖基化肽段的離子化效率會相對更低一些，也就更難被檢測到了。

? ? 以上所說的是由于糖基化修飾本身所帶來的研究難點。面對這種困難，研究者們選擇的是在進行質譜分析前對樣品進行特殊的操作處理，我們把這種處理步驟稱之為富（enrichment）。糖基化蛋白質組學研究發(fā)展到了今天，各種富集方法和富集策略早已發(fā)展得十分成熟，且應用于各種實際樣本中，獲得了成功。簡而言之，常見的富集技術就是那么幾類（可參考文獻Specific enrichment methods for glycoproteome research. Lijuan Zhang, et al. Anal Bioanal Chem (2010) 396: 199-203.）：凝集素親和色譜法、免疫親和色譜法、親水性相互作用色譜法（HILIC）、酰肼化學固相萃取法、硼酸固相萃取法等。不同的富集方法，各有其優(yōu)點及固有局限。像凝集素親和色譜法、免疫親和色譜法和硼酸固相萃取法在某些領域非常受歡迎，而在大規(guī)模糖蛋白質組學研究時，研究者們可能更偏愛酰肼化學法和親水性相互作用色譜法。在糖基化蛋白質組學研究發(fā)展的初期，酰肼化學法因其超高特異性而深受青睞。繼2003年Zhang Hui教授發(fā)表了第一篇基于酰肼化學富集法的糖蛋白質組研究工作后（酰肼化學法原理見圖3，摘自Nat Biotechnol. 2003 Jun；21(6): 660-666.），不僅有后來者沿用其原理在技術本身上做了創(chuàng)新性的工作（Highly specific enrichment of N-linked glycopeptides based on hydrazide functionalized soluble nanopolymers. Lijuan Zhang, et al. Chem. Commun., 2014, 50, 1027-1029.），酰肼化學富集法同樣被應用于DIA技術研究糖蛋白組的工作中（Yansheng Liu,et al.Molecular & Cellular Proteomics,2014,13,1753-1768.）。然而，酰肼化學富集有個固有的缺陷，那就是經(jīng)過酰肼富集的糖基化蛋白/肽段上的糖鏈結構遭到了破壞，只能得到糖基化位點的信息。至于該位點上到底有哪些種類的糖型結構，我們一無所知。當然，這在前幾年，質譜硬件條件和軟件算法都還沒對完整糖肽解析有特別貢獻的情況下，采用高特異性的酰肼富集方法，我們能夠在蛋白和肽段層面對糖基化修飾進行大規(guī)模的定性定量研究，這就極大的推動了糖基化蛋白質組的研究進程了。

?? 而在今天，自從Thermo推出了Orbitrap Fusion Tribrid質譜后，不論是儀器本身的高精度、高靈敏度、高分辨率、超高速度的掃描，還是碎裂模式、能量調節(jié)方面，可以說都提供了較為理想的硬件條件，間接的也對糖基化蛋白質組研究起了非常大的促進和推動作用。再有一個，更多的研究者們開始將注意力轉向糖基化肽段上糖型的變化，為此在分析方法、儀器參數(shù)設置、數(shù)據(jù)處理算法方面都做出了巨大的努力和貢獻。2017年，復旦大學的楊芃原教授和中科院計算所的賀思敏教授課題組在Nature Communications上聯(lián)合發(fā)表了采用國內自主研發(fā)的pGlyco軟件實現(xiàn)了大規(guī)模完整糖肽的精確解析工作，在一次實驗中同時完成肽段、糖鏈、完整糖肽三方面的定性與定量分析，并且能夠控制三個層面上的低假陽性率檢出，可以說是極大程度的提高了當今完整糖肽的質譜鑒定水平（圖4）。

? ? 后修飾蛋白質組學一直算得上是蛋白質組領域內難度和挑戰(zhàn)性最高的分支課題了，這其中尤以糖基化蛋白質組更是讓人又愛又恨?；厮菡麄€糖蛋白質組學的研究進程，可以很清楚的看到，初期大家將目光和重點放在發(fā)展各項糖基化蛋白/肽段富集新技術上，并力圖將這些技術應用于實際樣本的大規(guī)模糖基化位點的研究中。而后，隨著各項富集技術的不斷優(yōu)化和成熟，同時伴隨著質譜儀器的更新?lián)Q代以及軟件算法的日新月異，研究者們不再止步于修飾位點的鑒定，更多的考慮的是在完整糖肽水平去深入挖掘更有意義的數(shù)據(jù)，因為大量的研究表明特定修飾位點上糖型的變化很可能預示著某些生理功能的改變，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。當然，我們現(xiàn)在談到的都是N-糖基化蛋白質組學研究。至于O-糖基化蛋白質組，我只能很遺憾的說，其發(fā)展遠遠落后于N-糖基化蛋白質組，這是與O-糖基化修飾本身的特點密切相關的（O-糖基化修飾種類繁多，位點沒有保守序列，糖鏈結構也更為復雜，數(shù)據(jù)庫信息非常有限），在不遠的將來，這也必然是研究者們會重點關注和投入力量的領域。