納米抗體作為一種用途廣泛的小分子抗體，因其體積小、親水性強、穩(wěn)定性好、易于生產(chǎn)等優(yōu)勢越來越受歡迎，尤其在疾病診斷與治療、病原檢測、藥物殘留分析、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域都展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。

?

納米抗體

納米抗體(Nanobody，Nb)指重鏈單域抗體VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody) ，該類抗體只包含一個重鏈可變區(qū)（VHH）和CH2，CH3區(qū)，相比于其他抗體，輕鏈天然缺失。納米抗體晶體直徑2.5nm，長4nm，分子量一般在12-15KD，是自然存在的可以和抗原結(jié)合的最小片段。

?

納米抗體VHH的表面大概只有10個氨基酸與人VH的不同，在FR2中存在有四個特異的氨基酸：普通抗體FR2中V37、G44、L45和W47這4個氨基酸殘基是在進化中相當保守的疏水性殘基，而VHH中，這四個突變?yōu)橛H水性的氨基酸殘基F37、E44、 R45、G47，增加了VHH的水溶性。利用這一特性，可將人源抗體VH的序列進行優(yōu)化，對FR2中的一些氨基酸進行VHH特征性改造，從而使VH抗體的穩(wěn)定性和溶解性更好，并且保持原有的特異性和親和力。

?

納米抗體和傳統(tǒng)抗體的優(yōu)劣對比

?

納米抗體的制備

目前，制備納米抗體主要途徑使用免疫庫和天然庫進行制備。普健生物通過十余年的抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)的積累和迭代，具備完善的納米抗體天然庫和免疫庫制備平臺，提供羊駝免疫，納米抗體VHH噬菌體建庫及淘選技術(shù)服務(wù)，更有千億級VHH納米抗體天然噬菌體文庫可淘選各類靶點抗原，大大縮短藥物開發(fā)周期。

?

針對靶點B的特異性納米抗體制備過程

普健生物可以提供針對特定靶點的特異性納米抗體定制服務(wù)，包括抗原檢測，羊駝免疫，采血，效價檢測，納米抗體噬菌體庫構(gòu)建及淘選，特異性高親和力納米抗體篩選，表達，檢測一條龍服務(wù)。親和力可以達到108~1010M級別。

?

1.?靶點B免疫羊駝，進行四輪免疫后采血提取PBMC，經(jīng)RNA提取，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后擴增獲取VHH可變區(qū)片段；

2. 免疫羊駝納米抗體庫的構(gòu)建：

將獲得的VHH可變區(qū)片段連入噬菌體展示載體，電轉(zhuǎn)宿主菌，最終獲得庫容為8.76x10^9納米抗體庫，插入正確率為100%

3. 免疫羊駝納米抗體庫的淘選及篩選：

利用構(gòu)建的免疫羊駝納米抗體庫，針對靶點B蛋白，完成三輪淘選，其淘選富集度如下：

?

篩選96個克隆，其中陽性克隆共94個，陽性率為97.9%。

排除重復(fù)序列，最終獲得了7條不同的抗體序列。將這些抗體序列表達成可溶性的VHH抗體蛋白，進行再次驗證，結(jié)果如下：

隨機挑選兩條抗體蛋白進行親和力測定，結(jié)果如下：

R1P1-A10：KD：6.49E-09M

R1P1-H12：KD：1.52E-07M