相信大部分同學(xué)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室第一接觸的實(shí)驗(yàn)就是質(zhì)粒提取，雖然質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)相對(duì)簡(jiǎn)單，但是還是有很多問題需要我們提防和解決的，今天小海星就為大家簡(jiǎn)單介紹一下質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)中常遇到的一些問題。?

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或者表達(dá)的重要媒介，常用的方法有煮沸裂解法、堿提法等。而我們常用的?kit 是采用堿提法。

不同品牌的試劑盒具體操作步驟可能不同，但這個(gè)萬變不離其宗，基礎(chǔ)知識(shí)點(diǎn)還是不變的。菌體在強(qiáng)堿性條件下裂解，釋放出包括質(zhì)粒在內(nèi)的核酸，蛋白等物質(zhì)。pH恢復(fù)中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA 復(fù)性快，而線性的染色體 DNA 復(fù)性緩慢，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體 DNA 會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，而后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。

當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí)，復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒 DNA。

質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)會(huì)遇到的問題

1.?未提出質(zhì)粒或提取質(zhì)粒得率低

1）提取質(zhì)粒的甘油菌使用錯(cuò)誤對(duì)應(yīng)抗性的培養(yǎng)基培養(yǎng)

2）菌體質(zhì)?？截悢?shù)低或無質(zhì)粒，菌質(zhì)?？截悢?shù)低往往提取的質(zhì)粒含量低，某些菌體在多次轉(zhuǎn)接后可能出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的情況3）堿裂解時(shí)間不充分，導(dǎo)致裂解不徹底，菌體中質(zhì)粒未全部提取

2.?基因組污染或蛋白質(zhì)

1）加入裂解液時(shí)搖晃劇烈及裂解時(shí)間過長(zhǎng)，菌體基因組未與菌體蛋白質(zhì),細(xì)胞壁相互纏繞形成復(fù)合物并與十二烷基硫酸鹽結(jié)合成沉淀

2）離心白色絮狀物時(shí)間不充分，導(dǎo)致上清液并不澄清混有蛋白質(zhì)

3）不要使用過多菌體，導(dǎo)致上清液不夠澄清

3.質(zhì)粒降解

1）質(zhì)粒提取完成后避免反復(fù)凍融

2) ?質(zhì)粒溶解時(shí)吹打混勻時(shí)避免吹打過力，造成機(jī)械損傷

3）最后溶解質(zhì)粒時(shí)應(yīng)在超凈工作臺(tái)避免引入核酸酶造成質(zhì)粒降解

以上就是小海星為大家準(zhǔn)備的質(zhì)粒提取避坑指南，希望對(duì)大家的實(shí)驗(yàn)有所幫助。關(guān)注小海星，實(shí)驗(yàn)不重新。

作者：海星生物

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