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通常情況下，蛋白質(zhì)組學(xué)分析的做法是處理新鮮冷凍的腫瘤組織。然而，由于新鮮冷凍標(biāo)本的腫瘤收集在總樣本數(shù)量方面會(huì)受到限制，并且這些樣品往往缺乏足夠長(zhǎng)的隨訪信息,導(dǎo)致了其實(shí)際的研究意義受限。因此，福爾馬林固定石蠟包埋?(FFPE)?標(biāo)本因其長(zhǎng)期的穩(wěn)定性與含有臨床結(jié)果的常見(jiàn)信息等優(yōu)勢(shì)，成為回顧性研究中十分有吸引力的資源。來(lái)自柏林Max Delbrück分子醫(yī)學(xué)中心、柏林衛(wèi)生研究所(BIH)的一組研究人員已經(jīng)成功地使用質(zhì)譜儀詳細(xì)分析了肺癌組織固定樣本中的蛋白質(zhì)。并在Nature?Communications雜志上發(fā)表了題為Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories的研究論文。

實(shí)驗(yàn)流程

Philipp Mertins博士等人評(píng)估了（磷酸）蛋白質(zhì)組學(xué)在?FFPE?肺組織上的蛋白質(zhì)提取、量化、預(yù)分析和樣本大小的可行性。在比較蛋白質(zhì)提取方案后，使用的方案并采用串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽?(TMT)?方法從肺鱗狀細(xì)胞和腺癌中獲取深度（磷酸）蛋白質(zhì)組，其中含有大于8,000個(gè)量化蛋白質(zhì)和14,000多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)微尺度方法，量化了7,000個(gè)磷酸化位點(diǎn)，從而能夠分析具有有限樣本量的?FFPE?活檢。Philipp Mertins博士等人還研究了分析前變量（包括固定時(shí)間和熱輔助去交聯(lián)）對(duì)蛋白質(zhì)提取效率和蛋白質(zhì)組覆蓋率的影響。他們改進(jìn)的工作流程提供了關(guān)于肺癌中最相關(guān)的癌基因、腫瘤抑制基因和信號(hào)通路的蛋白質(zhì)豐度和磷酸化位點(diǎn)調(diào)控的定量信息。最后，重點(diǎn)介紹了用于重點(diǎn)臨床研究的全面（磷酸化）蛋白質(zhì)組分析的?TMT?方法和用于大型隊(duì)列的無(wú)標(biāo)記方法。

結(jié)果速遞

首先比較了三種已發(fā)表的從?FFPE?樣品中提取蛋白質(zhì)的方案，由整體蛋白質(zhì)組覆蓋率、肺癌相關(guān)的蛋白質(zhì)組覆蓋率以及四次重復(fù)的可重復(fù)性等方面的結(jié)果表明?，SDS-SP3在三種測(cè)試方案中從肺癌?FFPE?樣本中提取蛋白質(zhì)的效果。

其次，對(duì)新鮮冷凍與福爾馬林固定標(biāo)本的蛋白質(zhì)組進(jìn)行直接比較，結(jié)果顯示蛋白質(zhì)鑒定沒(méi)有重大差異，其對(duì)蛋白質(zhì)鑒定質(zhì)量的影響很小。?使用新鮮制備的福爾馬林固定細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)也顯示，與新鮮冷凍材料相比，蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組覆蓋率只有很小的差異。表明對(duì)于大型臨床?FFPE?隊(duì)列的蛋白質(zhì)組學(xué)分析的研究設(shè)計(jì)，固定時(shí)間不一定是選擇標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)?TMT?技術(shù)可以成功應(yīng)用于臨床?FFPE?樣本，提供有關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)和磷酸化水平的相關(guān)信息。并且TMT方法非常適合對(duì)切除的?FFPE?組織進(jìn)行研究，通過(guò)優(yōu)化?TMT?技術(shù)，即使是少量樣本也能實(shí)現(xiàn)深度蛋白質(zhì)組覆蓋。對(duì)于切片的?FFPE?組織，通過(guò)?TMT?實(shí)驗(yàn)可以定量檢測(cè)到?8000多種蛋白質(zhì)和超過(guò)14000?個(gè)磷酸化位點(diǎn)。最后對(duì)常用?FFPE?蛋白質(zhì)提取方案、蛋白質(zhì)組學(xué)量化方法和不同?FFPE?樣本類型的樣本量要求進(jìn)行系統(tǒng)比較，指出LFQ?只需要少量的樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，樣本制備時(shí)間相對(duì)較短，在質(zhì)譜儀上每個(gè)樣品的測(cè)量時(shí)間最少。因此，LFQ?特別適合研究中等覆蓋率的數(shù)百個(gè)樣本的大型隊(duì)列。然而，對(duì)于磷酸化蛋白質(zhì)組分析，由于對(duì)每個(gè)樣本的樣本量要求相對(duì)較高，該方法受到限制。?TMT?方法可提供更深的蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組，但考慮到用于標(biāo)記、分級(jí)和脫鹽的額外樣品處理步驟，需要相對(duì)較高的樣本量和更多的樣本制備時(shí)間。而微尺度?TMT?方法的一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)就是它提供了對(duì)蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組水平的深入覆蓋的同時(shí)，又不需要較高的樣本量，從而能夠?qū)Ψ浅Ｐ〉呐R床標(biāo)本（例如針芯活檢）進(jìn)行全面的蛋白質(zhì)組學(xué)表征。

整體而言，質(zhì)譜驅(qū)動(dòng)的蛋白質(zhì)組學(xué)LFQ?和?TMT?中常用的量化方法在分析?FFPE?組織方面都有不同的應(yīng)用，各自具有不同的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，并在功能蛋白質(zhì)組水平上提供了多種技術(shù)選項(xiàng)來(lái)探索癌癥基因的改變。

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