01.為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白？

答：原因有很多：

a) 你的細胞中不表達這種蛋白質(zhì)，換一種細胞；
b) 你的細胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。

02.我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？

答：a) 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性完全，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長；
b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。

03.我做的蛋白質(zhì)分子量很小(10KD),請問怎么做WB？

答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。

04.我的目的帶很弱，怎么加強？

答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。?

05.膠片背景很臟，有什么解決方法？

答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。?

06.目標帶是空白，周圍有背景，是為什么？

答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應(yīng)時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。

07.我的膠片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；d) 二抗失活。?

08.我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片是什么原因呢?

答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善；b) 顯影時間過長。?

09.DAB好還是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。?

10.抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？

答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體；b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。?

答：可能是：a)樣品濃度過低；b)轉(zhuǎn)移時間不夠。?

12.磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？

答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。?

13.要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？

答：① 免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進行定量，但是不能定位。② 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

14.電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象

︶ 條帶呈笑臉狀原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好; 電泳系統(tǒng)溫度偏高。

︵ 條帶呈皺眉狀原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。

拖尾原因：樣品溶解不好。

紋理（縱向條紋）原因：樣品中含有不溶性顆粒。

條帶偏斜原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

條帶兩邊擴散原因：加樣量過多。?

膜封閉不夠延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液。一抗稀釋度不適宜對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。一抗孵育的溫度偏高建議4℃結(jié)合過夜。選擇的膜容易產(chǎn)生高背景一般硝酸纖維素膜的背景會比PVDF膜低。膜在實驗過程中干過實驗過程中要注意保持膜的濕潤。檢測時曝光時間過長減少曝光時間。?

16.Western blot結(jié)果中雜帶較多可能的原因及建議

目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙?；稽c等），本身可以呈現(xiàn)多條帶。查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。目的蛋白有其它剪切本查閱文獻或生物信息學分析可能性。樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。上樣量過高，太敏感適當減少上樣量。一抗特異性不高重新選擇或制備高特異性的抗體。一抗不純純化抗體一抗或者二抗?jié)舛绕呓档涂贵w濃度。?

17.?Western?blot結(jié)果中無信號或顯示信號弱可能的原因及建議

檢測樣本不表達目的蛋白選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性。檢測樣本低表達目的蛋白提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流?？贵w不能識別測試種屬的相關(guān)蛋白購買抗體前應(yīng)當認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應(yīng)蛋白。一抗孵育時間不足建議4℃結(jié)合過夜。二抗與一抗不匹配選擇針對一抗來源的種屬的抗體。洗膜過度洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。

18.其它現(xiàn)象

膜上多處出現(xiàn)黑點或黑斑原因：抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合。反白（條帶顯白色）原因：目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕?。蛋白分子量偏低或偏高原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。?

19.?安全問題

操作有毒試劑時，帶手套和口罩，且操作揮發(fā)性試劑應(yīng)在通風櫥中進行。

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細胞基因敲除

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