直腸癌（colorectal cancer）是人類常見的惡性腫瘤之一。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病率位居惡性腫瘤的第二位。生物靶標(biāo)的研究對(duì)于直腸癌的治療有著重要意義。在過去幾十年的許多研究中已經(jīng)揭示了許多潛在的直腸癌生物靶標(biāo)，但是卻缺乏對(duì)血液中生物靶標(biāo)的研究。這篇文章就使用靶向蛋白組學(xué)研究的手段針對(duì)血液中的直腸癌靶標(biāo)進(jìn)行大規(guī)模研究，為直腸癌早起診斷提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：靶向蛋白組學(xué)、SRM、生物標(biāo)志物

Quantitation of putative colorectal cancer biomarker candidates in serum extracellular vesicles by targeted proteomics Scientific Reports －06 October 2017

研究方法

靶向蛋白組學(xué) Targeted proteomics－SRM

研究結(jié)果

1. 作者通過在Pubmed中輸入cancer＋colorectal＋expression搜索在2003年到2014年間報(bào)道過的直腸癌（CRC）的潛在生物標(biāo)志物。這些標(biāo)志物通過以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確定：通過western blot，Elisa等方法確認(rèn)在CRC中表達(dá)有差異的蛋白；或通過iRNA相關(guān)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)與CRC疾病發(fā)展相關(guān)；以及通過大規(guī)模組學(xué)鑒定法發(fā)現(xiàn)的潛在生物靶點(diǎn)。由于血清中的蛋白眾多，蛋白豐度差異大，直接對(duì)血清中的靶標(biāo)進(jìn)行全面研究難度較大，因此作者選用了血清中的extracellular vesicles（EVs）組分進(jìn)行研究。并且制定了一下的鑒定CRC靶標(biāo)的策略：先使用shotgun proteomics鑒定EVs中的所有蛋白。再從中選出CRC的潛在生物靶點(diǎn)，使用SRM對(duì)這些潛在靶點(diǎn)做定向研究，從而確認(rèn)其中真實(shí)可靠的CRC生物靶點(diǎn)。

2. 制定鑒定策略后，作者首先提取了血清和CRC細(xì)胞的EVs，并使用了shotgun proteomics鑒定技術(shù)分別對(duì)這兩個(gè)組分的所有蛋白進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果（圖b－韋恩圖）分別標(biāo)明了血清、CRC細(xì)胞的EVs組分的所有蛋白和文獻(xiàn)搜索的潛在CRC生物靶標(biāo)的種類，以及各自相交重復(fù)的數(shù)量。血清、CRC的EVs組分蛋白與文獻(xiàn)搜索的潛在CRC靶標(biāo)的相交部分（下圖紅色加粗字體）即為EVs組分中的潛在生物靶點(diǎn)。

3.作者使用SRM靶向蛋白組學(xué)的研究手段對(duì)以上確認(rèn)的潛在生物靶點(diǎn)進(jìn)行了鑒定（鑒定的步驟包括靶向肽段的選取，SRM對(duì)靶向肽段的鑒定，靶向蛋白分析）。作者選取了正常人，非轉(zhuǎn)移的CRC病人，轉(zhuǎn)移的CRC病人的血清樣品，分別提取EVs，再使用SRM進(jìn)行鑒定。下圖顯示了部分靶向肽段在三個(gè)樣品中的含量，由此反映三個(gè)樣品中各項(xiàng)生物靶標(biāo)的表達(dá)水平。其中對(duì)比對(duì)照組是否具有顯著性差異也在圖中進(jìn)行了標(biāo)注（*p?<?0.05, **p?<?0.01, N.S: 非顯著性差異）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)靶標(biāo)蛋白屬于Annexin蛋白家族，包括Annexin A3，A4，A11。

4. 在了進(jìn)一步研究以上生物靶標(biāo)在鑒定早期CRC的靈敏度，作者還使用了SRM對(duì)CEA（特異性鑒定后期轉(zhuǎn)移CRC的生物靶標(biāo)）在正常人、非轉(zhuǎn)移CRC、轉(zhuǎn)移的CRC三個(gè)組分的水平進(jìn)行研究。結(jié)果標(biāo)明CEA在非轉(zhuǎn)移CRC樣品中表現(xiàn)出差異的比例為僅38.8%，在轉(zhuǎn)移性的CRC中表現(xiàn)差異的比例為83.3%，這反映出CEA在作為后期CRC的生物靶標(biāo)更為靈敏，而在前期CRC鑒定中差異不明顯。與CRC相比，先前鑒定的EVs中的生物靶標(biāo)在非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移的CRC樣品中都具有至少近80%以上的靈敏度，這表明這些靶標(biāo)蛋白能夠作為前期和后期CRC的生物靶標(biāo)，為CRC早期鑒定提供重要的依據(jù)。

5. 確認(rèn)以上鑒定的生物靶標(biāo)的可靠性后，作者選取新一組的病人樣品，在這些樣品中對(duì)以上靶標(biāo)肽段進(jìn)行了鑒定，結(jié)果標(biāo)明與之前的鑒定一致，這也再次驗(yàn)證了以上靶標(biāo)的可靠性。