癌癥是一種高度復(fù)雜的疾病，其特征不僅是惡性細(xì)胞的過度生長(zhǎng)，而且是免疫應(yīng)答的改變。免疫系統(tǒng)的抑制和重新編程在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。免疫治療旨在激活抗腫瘤免疫細(xì)胞并克服腫瘤的免疫逃逸機(jī)制。

以免疫檢查點(diǎn)阻斷和過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移為代表的腫瘤免疫治療在臨床上取得了巨大成功，能夠有效誘導(dǎo)對(duì)所有其他治療都無效的一些腫瘤長(zhǎng)期消退。其中，以PD-1/PD-L1抑制劑（納武利尤單抗）和CTLA-4抑制劑（伊匹木單抗）為代表的免疫檢查點(diǎn)阻斷療法，在治療各種惡性腫瘤，如非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤等，取得令人鼓舞的治療效果。

此外，隨著CAR-T、CAR-M等新型免疫治療方法在血液腫瘤領(lǐng)域的出色表現(xiàn)，免疫治療進(jìn)入了一個(gè)發(fā)展的新階段。

雖然近年來涌現(xiàn)出了多種腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)和候選藥物，但大多數(shù)仍處于非常早期的發(fā)展階段。不幸的是，臨床研究表明，這些候選藥物中的相當(dāng)一部分可能無法作為單一療法發(fā)揮令人滿意的效果。

因此，如何有效探尋不同腫瘤治療手段的聯(lián)合治療方案，以及ICB（免疫檢查點(diǎn)抑制劑）和CAR-T治療的臨床療效相關(guān)的生物標(biāo)記物，是當(dāng)下腫瘤免疫及細(xì)胞療法的關(guān)鍵所在。

腫瘤免疫治療發(fā)展

1891年，美國(guó)紐約紀(jì)念醫(yī)院的整形外科醫(yī)生William B Coley將活的或者滅活的釀膿鏈球菌混合物注射到腫瘤部位，刺激癌癥病人的免疫系統(tǒng)，治療骨腫瘤，這應(yīng)該是第一個(gè)腫瘤免疫治療案例。在發(fā)現(xiàn)特異性免疫細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)分子之前，腫瘤免疫治療的應(yīng)用幾乎沒有進(jìn)展。

1974年，白細(xì)胞介素（IL）-2被發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)中起重要的作用。Steven Rosenberg團(tuán)隊(duì)通過IL-2在腫瘤患者中的應(yīng)用，是現(xiàn)代免疫治療的里程碑事件，并在20世紀(jì)80年代促進(jìn)了其他細(xì)胞因子刺激癌癥患者的免疫反應(yīng)的研究熱度。

然而，直接向患者注射細(xì)胞因子可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的的毒副作用，這就需要發(fā)現(xiàn)能夠介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)且能夠精準(zhǔn)定位腫瘤部位的特異性免疫細(xì)胞。

?圖1.?癌癥免疫治療發(fā)展的歷史里程碑

T細(xì)胞激活是抗病毒和抗腫瘤適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵，主要通過雙信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

第一信號(hào)是抗原特異性信號(hào)，涉及T細(xì)胞表面受體（TCR）與抗原肽主要組織相容性復(fù)合體（MHC）的特異性結(jié)合。

第二信號(hào)由抗原呈遞細(xì)胞（APC）表面的共刺激分子提供，為非特異性協(xié)同刺激信號(hào)。

如何有效的促進(jìn)T細(xì)胞的活化并對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行清除，是腫瘤免疫治療的核心。

圖2.?免疫檢查點(diǎn)抑制劑及其受體列表

免疫檢查點(diǎn)阻斷治療

免疫檢查點(diǎn)（immune checkpoint ，IC）是一類在免疫細(xì)胞上表達(dá)的免疫抑制分子，可以抑制免疫細(xì)胞激活，因此在自身免疫預(yù)防中起著關(guān)鍵作用。相反，IC的過度表達(dá)抑制免疫功能和有助于腫瘤發(fā)生。因此，免疫檢查點(diǎn)阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）治療通過阻斷IC，解除免疫抑制信號(hào)，繼而增強(qiáng)抗腫瘤T細(xì)胞活性來抑制腫瘤生長(zhǎng)。

目前，ICB治療主要是通過兩條IC途徑進(jìn)行，PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/2 通路。

圖3.?PD-1抗體作用機(jī)制示意圖

PD-1

研究發(fā)現(xiàn)，PD-1（程序性死亡受體-1，programmed cell death protein-1）能夠抑制T淋巴細(xì)胞的功能，這對(duì)維持自身免疫耐受是至關(guān)重要的。PD-L1（最初被鑒定為B7-H1）在多種類型的腫瘤中高度表達(dá)，可以與PD-1結(jié)合并介導(dǎo)腫瘤免疫逃避。因此，抑制PD-1可以重新激活T細(xì)胞功能。

最近的研究還表明，PD-1不僅在T細(xì)胞上表達(dá)，而且在NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）上也表達(dá)，提示PD-1可能在重塑腫瘤免疫微環(huán)境甚至全身抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮非常有效的作用。

PD-1抑制劑可以與PD-1特異結(jié)合，從而減弱T淋巴細(xì)胞的免疫抑制調(diào)節(jié)和促使T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞功能的發(fā)揮（圖3）。臨床前研究表明，PD-1抑制劑可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡（凋亡）。PD-1抗體還可以增強(qiáng)由其他細(xì)胞毒性藥物（如阿霉素）介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。

CTLA-4

CTLA-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein- 4，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4），也稱為CD152，是一種跨膜蛋白，在活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞中表達(dá)。雖然CD28被發(fā)現(xiàn)是一種T細(xì)胞共刺激分子，但后來發(fā)現(xiàn)CTLA-4雖然與CD28相似，但對(duì)T細(xì)胞激活起到剎車作用。

在生理?xiàng)l件下，CTLA-4和CD80/CD86結(jié)合可以抑制T細(xì)胞激活信號(hào)并預(yù)防自身免疫性疾病的發(fā)生。阻斷CTLA-4可以直接靶向效應(yīng)T細(xì)胞的抑制信號(hào)，降低Tregs的抑制作用，從而有效增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤作用。

1996年，James Allison發(fā)現(xiàn)阻斷CTLA-4導(dǎo)致小鼠腫瘤消退。在隨后的人體研究中，伊匹木單抗（CTLA-4抗體）是第一個(gè)在臨床研究中應(yīng)用的CTLA-4抑制劑，成功抑制了難治性轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的疾病進(jìn)展，這是癌癥免疫治療的里程碑。

有趣的是，CTLA-4在黑色素瘤、肺癌和腎癌浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞表面高度表達(dá)。雖然后來研究發(fā)現(xiàn)，Treg清除不是伊匹木單抗臨床抗腫瘤療效的主要機(jī)制，但這些結(jié)果表明，在某些情況下，CTLA-4抗體也可能抑制TME中的Treg細(xì)胞，并有助于免疫激活。

圖4.?CTLA-4和PD-1圖解

PD-1聯(lián)合CTLA-4

雖然PD-1和CTLA-4都是具有代表性的IC分子，但CTLA-4和PD-1以不同方式調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能（圖4）。CTLA-4的抑制信號(hào)負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的啟動(dòng)，PD-1主要介導(dǎo)啟動(dòng)T細(xì)胞的隨后激活和增殖。

圖5. PD-1和CTLA-4阻斷后T細(xì)胞亞群變化

在抗腫瘤治療方面，以PD-1為靶點(diǎn)的ICB通常會(huì)導(dǎo)致現(xiàn)有抗腫瘤T細(xì)胞的擴(kuò)張和招募，而抗CTLA-4治療會(huì)產(chǎn)生新的T細(xì)胞克隆。此外，抗CTLA-4治療可誘導(dǎo)Th1樣CD4+亞群的增殖，這在抗PD-1治療中未觀察到。這些結(jié)果表明，CTLA-4和PD-1可能同時(shí)具有協(xié)同抗腫瘤作用。

CTLA-4和PD-1 ICB的聯(lián)合治療（納武利尤單抗聯(lián)合伊匹木單抗）確實(shí)產(chǎn)生了良好的臨床反應(yīng)，但比單一治療產(chǎn)生了更顯著的不良反應(yīng)，期待更為有效的協(xié)同抗腫瘤方案的出現(xiàn)。

隨著免疫檢查點(diǎn)CTLA-4、PD-1，及其配體PD-L1的相繼發(fā)現(xiàn)，相關(guān)抗體藥物的研發(fā)也進(jìn)入到快車道。相繼推動(dòng)伊匹木單抗、納武利尤單抗、帕博利珠單抗、度伐利尤單抗等免疫檢查點(diǎn)抑制劑問世，將腫瘤治療由化療、靶向治療時(shí)代引進(jìn)到免疫治療時(shí)代，開啟了腫瘤免疫治療的新篇章。

CAR-T治療

與免疫檢查點(diǎn)抑制劑在實(shí)體瘤領(lǐng)域的快速進(jìn)展，在血液腫瘤領(lǐng)域進(jìn)展迅速的是CAR-T(Chimericantigen receptor T-cell，嵌合抗原受體T細(xì)胞)療法。

圖5. CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)

CAR-T療法屬于過繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移(adoptive T-cell transfer，ACT)的一種。CAR(嵌合抗原受體)是一種基因工程技術(shù)制造的人工受體分子，它可以賦予免疫效應(yīng)細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞)針對(duì)某個(gè)靶點(diǎn)抗原表位的特異性，從而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原信號(hào)與活化的功能，繼而回輸淋巴細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤，抗病毒或抗炎作用。與免疫檢查點(diǎn)抑制劑一樣，也是依托于T淋巴細(xì)胞發(fā)揮主要作用。

圖6.?CAR-T治療流程

這種作用機(jī)制付諸于臨床實(shí)踐，源于技術(shù)進(jìn)步。經(jīng)過20年T細(xì)胞工程的精細(xì)調(diào)整，能夠通過將識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的scFv和胞內(nèi)信號(hào)域“免疫受體酪氨酸活化基序”（ITAM，通常為CD3ζ）在體外進(jìn)行基因重組，生成重組質(zhì)粒，再在體外通過轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染到患者的T細(xì)胞，使患者T細(xì)胞表達(dá)腫瘤抗原受體。轉(zhuǎn)染后經(jīng)過純化和大規(guī)模擴(kuò)增后的T細(xì)胞，就是所謂的CAR-T細(xì)胞。

完整的CAR-T結(jié)構(gòu)包括抗原結(jié)合區(qū)、跨膜鏈接區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)三個(gè)部分。從而使得T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了抗原特異性的、非MHC限制的活化及其效應(yīng)的增強(qiáng)。

目前，CAR-T細(xì)胞療法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了5次技術(shù)迭代（圖7）。技術(shù)的進(jìn)步，也促進(jìn)了產(chǎn)品的不斷獲批上市。

圖7. ?CAR-T技術(shù)的迭代

2017年8月30日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了諾華的第一款CAR-T產(chǎn)品Kymriah，治療3~25歲復(fù)發(fā)或難治性急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）的患者。之后，又批準(zhǔn)了其他六種針對(duì)白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品。

表1.?可用CAR-T療法列表

目前，約1000項(xiàng)注冊(cè)臨床研究正在進(jìn)行中，涉及的癌種包括白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤和其他惡性腫瘤等。

CAR-T治療的局限性

盡管取得了上述臨床成功，但CAR-T細(xì)胞治療的廣泛應(yīng)用仍然受到來自不同方面的挑戰(zhàn)。

• 首先，當(dāng)攻擊腫瘤細(xì)胞時(shí)，CAR-T細(xì)胞可能會(huì)引起嚴(yán)重的副作用和毒性，這些副作用甚至是致命的。

  
  

• 其次，一些CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性不是腫瘤特異性的，可能會(huì)對(duì)正常組織造成損害。

  
  

• 第三，大多數(shù)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的制造過程很耗時(shí)，這可能導(dǎo)致一些患者在細(xì)胞生成窗口期腫瘤進(jìn)一步惡化。

  
  

• 此外，CAR-T治療血癌的長(zhǎng)期療效仍需長(zhǎng)期隨訪觀察，而CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤的應(yīng)用尚需進(jìn)一步研究。

這些挑戰(zhàn)將決定未來整個(gè)T細(xì)胞工程領(lǐng)域的發(fā)展方向。

細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）

細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS），也稱為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，是CAR-T治療最常見的不良反應(yīng)。CAR-T細(xì)胞輸注后，IL-6和IL-13的快速升高可引發(fā)全身炎癥反應(yīng)。臨床表現(xiàn)主要包括發(fā)熱、疲勞、頭痛、癲癇、惡心、寒戰(zhàn)和呼吸困難。嚴(yán)重CRS患者可能會(huì)出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、低血壓、心動(dòng)過速、肝損傷、腎衰竭和暴發(fā)型噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥（HLH），這些都可能致命。

CRS通常發(fā)生在CAR-T輸注后一周內(nèi)，輸注后1—2周出現(xiàn)峰值。

值得注意的是，在CRS的病理生理過程中，除了活化的CAR-T細(xì)胞外，內(nèi)源性免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和/或樹突狀細(xì)胞，也參與各種細(xì)胞因子的合成和釋放以及加重臨床CRS癥狀。

CRISPR技術(shù)促進(jìn)細(xì)胞免疫治療

最近，CRISPR/Cas9技術(shù)極大地促進(jìn)了我們對(duì)于腫瘤基因組學(xué)的理解和腫瘤免疫治療的進(jìn)展。通過基因組編輯系統(tǒng)，治療性免疫細(xì)胞可以被進(jìn)一步改造以增強(qiáng)腫瘤識(shí)別能力和減少衰竭（圖8）。

圖8.?基于CRISPR技術(shù)的免疫治療工作流程

2016年，中國(guó)四川大學(xué)啟動(dòng)了首次使用CRISPR工程化T細(xì)胞的臨床研究；

2020年，一項(xiàng)臨床研究報(bào)告使用PD-1敲除T細(xì)胞治療放療和化療無效的非小細(xì)胞肺癌患者；

這表明CRISPR工程在T細(xì)胞中是安全的，這為將CRISRP技術(shù)與其他T細(xì)胞修飾方法相結(jié)合鋪平了道路。利用CRISPR介導(dǎo)的TCR和PD-1基因敲除進(jìn)行的NY-ESO-1 TCR-T細(xì)胞治療是臨床上第一個(gè)經(jīng)過進(jìn)一步基因修飾測(cè)試的腫瘤特異性T細(xì)胞。

此外，CRISPR基因編輯系統(tǒng)允許異體T細(xì)胞治療的更廣泛應(yīng)用。能夠有效降低CAR-T的生產(chǎn)成本，價(jià)格能夠得到有效降低，未來應(yīng)用前景廣闊。

ICB和CAR-T細(xì)胞免疫治療

ICB雖然已經(jīng)獲批諸多實(shí)體瘤適應(yīng)癥，然而，并非所有患者都能從ICB治療中受益，因此，確定生物標(biāo)記物（Biomarker）用于療效預(yù)測(cè)至關(guān)重要。

為了讓患者得到準(zhǔn)確有效的治療，以生物標(biāo)記物進(jìn)行患者篩選，準(zhǔn)確識(shí)別有藥物反應(yīng)的患者，并讓他們盡快接受最佳治療，防止不適當(dāng)?shù)膽?yīng)用可能導(dǎo)致的疾病進(jìn)展，是精準(zhǔn)腫瘤治療時(shí)代下的必然選擇。

表2. 腫瘤免疫治療的生物標(biāo)志物表單

在ICB治療中涉及的Biomarker包括PD-L1、TMB（腫瘤突變負(fù)荷）、MSI-H/dMMR（微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性/錯(cuò)配修復(fù)缺陷），這些Biomarker的探索，也源于伴隨診斷技術(shù)的進(jìn)步。

伴隨診斷（companion diagnostic，CD）屬于體外診斷范疇，應(yīng)用于：一是確定最有可能從某種治療產(chǎn)品中獲益的患者；二是確定因使用特定治療產(chǎn)品而可能增加嚴(yán)重副作用風(fēng)險(xiǎn)的患者；三是監(jiān)測(cè)特定治療產(chǎn)品對(duì)治療的反應(yīng)。包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、熒光原位雜交（FISH）、免疫組化（IHC）、高通量測(cè)序（NGS）。伴隨診斷技術(shù)的進(jìn)步促進(jìn)了更多Biomarker 的探索，包括ctDNA，TILs等。

最初探索ICB療效的Biomarker是PD-L1，近年來研究的熱點(diǎn)聚焦在MSI-H/dMMR上，因?yàn)镸SI-H/dMMR腫瘤患者本身體內(nèi)的腫瘤新抗原數(shù)量較多，理論上免疫是更為獲益的。所謂的腫瘤新抗原，又稱腫瘤特異性抗原（Tumor-specific antigen，TSA） ，是由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的體細(xì)胞突變，且僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，有比較強(qiáng)的腫瘤特異性和較高的免疫原性。能夠產(chǎn)生新抗原的突變即為具有免疫原性的突變（immunogenic mutation）。

但由于MSI-H/dMMR整體患者的陽性率較低，在泛癌種領(lǐng)域的應(yīng)用又缺乏大規(guī)模循證研究數(shù)據(jù)佐證，進(jìn)展較為緩慢。

循環(huán)腫瘤基因（循環(huán)腫瘤DNA），即ctDNA（ circulating tumor DNA），是近年來新發(fā)掘的一種預(yù)測(cè)免疫療效的biomarker, ctDNA是指腫瘤細(xì)胞體細(xì)胞DNA經(jīng)脫落或者當(dāng)細(xì)胞凋亡后釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，是一種特征性的腫瘤生物標(biāo)記。通過ctDNA檢測(cè)，能夠檢出血液中的腫瘤蹤跡。

加拿大癌癥中心進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性二期臨床研究，涉及5種不同類型晚期實(shí)體瘤患者接受帕博利珠單抗治療后，ctDNA水平變化與免疫效力之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，ctDNA水平與ICB的療效是相關(guān)的。

盡管CAR-T細(xì)胞治療B淋巴細(xì)胞白血病的初始CR率可能高達(dá)90%，但很大一部分患者會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。此外，并非所有淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤患者都能通過CAR-T細(xì)胞治療獲得滿意的療效，這就促進(jìn)了與CAR-T細(xì)胞療法相關(guān)的Biomarker的研究。

最為相關(guān)的Biomarker應(yīng)該是腫瘤抗原的表達(dá)，作為靶向治療，CAR-T細(xì)胞的性質(zhì)要求腫瘤細(xì)胞表達(dá)TAA以激發(fā)T細(xì)胞活性，這確實(shí)是CAR-T細(xì)胞治療療效的最關(guān)鍵的Biomarker。由于腫瘤抗原逃逸是CAR-T細(xì)胞治療后腫瘤復(fù)發(fā)的主要機(jī)制，一些研究還表明，下調(diào)而不是完全喪失TAA，會(huì)抑制CAR-T細(xì)胞功能。

雖然可以設(shè)計(jì)CAR-T細(xì)胞來提高其對(duì)低水平TAA的敏感性，但TAA表達(dá)密度可能成為預(yù)測(cè)性Biomarker。

其次，不同CAR-T的產(chǎn)品特征也可作為預(yù)測(cè)性的Biomarker。治療產(chǎn)品質(zhì)量的不一致一直是自體CAR-T細(xì)胞治療的主要挑戰(zhàn)?；颊咛峁┑某跏疾牧?，經(jīng)過多次治療后，相關(guān)的特征一定會(huì)發(fā)生改變。因此，與健康獻(xiàn)血者相比，腫瘤患者的T細(xì)胞亞群組成表現(xiàn)出更多的差異性。因此，產(chǎn)品質(zhì)量的差異是影響臨床結(jié)果的重要因素。

2018年，Kite Pharma評(píng)估了自家的多功能性CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，能夠有效的在單細(xì)胞水平上產(chǎn)生多種細(xì)胞因子釋放的能力，并與淋巴瘤的治療效果相關(guān)。

其他一些研究，對(duì)輸液產(chǎn)品的表型和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，隨著大規(guī)模研究的不斷驗(yàn)證，這些產(chǎn)品特性可以作為有用的生物標(biāo)記物，用于預(yù)測(cè)輸液前的臨床療效。

總? 結(jié)

免疫治療已成為繼手術(shù)、化療和放療之后抗腫瘤治療的第四種途徑，以ICB和CAR-T為代表的新型治療手段，已經(jīng)改寫了諸多瘤種的治療標(biāo)準(zhǔn)，但也存在一定的局限性，如ICB單藥治療患者響應(yīng)人群數(shù)量較低，免疫耐藥現(xiàn)象同樣較高，雙免疫聯(lián)合治療方案毒性較大，限制其在臨床大規(guī)模的應(yīng)用等。

CAR-T細(xì)胞療法存在生產(chǎn)成本高昂，CRS等毒副反應(yīng)難以摒除等缺點(diǎn)。隨著腫瘤精準(zhǔn)治療時(shí)代的到來，基于生物標(biāo)記物對(duì)人群進(jìn)行細(xì)分，更為有效的使用ICB和CAR-T產(chǎn)品，是未來研發(fā)的主流方向。期待更為有效的生物標(biāo)記物在臨床中得到驗(yàn)證，相關(guān)治療毒副反應(yīng)能夠有效降低，受益患者數(shù)量進(jìn)一步增加。

參考資料：

1.?Signal Transduction and Targeted Therapy (2022) 7:331.

2.?Blood Reviews, 2016. 30(3): p. 157-167.

3. Journal of Controlled Release, 2020. 319: p. 246-261.

4. Am J Cancer Res 2020;10(7):1979-1992.