200ml菌液一般能提15-20ug質粒。以200ml菌液為例提取低拷貝BAC質粒。(500ml離心管，50ml離心管，普通質粒大提試劑盒Omega，4℃大離心機>15000g/min)

1.?集菌：200ml LB培養(yǎng)基37℃過夜搖菌，6000g/10min集菌（500ml離心管），棄上清。

2.?重懸：用9ml solution I(+RNase)重懸沉淀（無顆粒即可），放2min。（沉淀過多，則可適當加點solution I，后面II/III按比例添加即可，可都在50ml離心管中進行）。

3.?加入9ml solution II，顛倒混勻，靜置1-3min，變透亮。

4.?加入12ml solution III，顛倒混勻，靜置1-3min。

5.?12000-15000g/30min，取上清至50ml離心管（有殘留物則重復離心一次）。

6.?上清加入0.7倍體積異丙醇（即若上清30ml, 則加入21ml異丙醇）充分混勻，可見溶液明顯變白色.10000-15000g/30min(大離心機)。輕輕將上清傾倒掉，可用紙巾將管壁異丙醇擦凈（避免擦掉DNA沉淀）。

7.?加入500ul Elution Buffer溶解DNA沉淀。

8.?將上述500ul DNA小提去內毒素即可（見以下步驟）

（1）500ul分兩管，各加250ul Solution I(+RNase)，使用移液器吹打完全混勻，將重懸的液體轉移至1.5mlEP管中

（2）各加250ul Solution II，輕柔上下顛倒混勻數(shù)次直至液體澄清，靜置孵育2-3min

（3）各加125ul?N3(預冷)，輕柔上下顛倒混勻數(shù)次直至出現(xiàn)絮狀白色沉淀(若加入N3則按小提去內毒素方法即可用于質粒轉染；若按普通提質粒法，則建議用氯仿、異丙醇/乙醇純化)

（4）13000r常溫離心10min以上，可見管底有白色沉淀（可能需要兩次）

（5）將上清轉移至新的1.5mlEP管，估算上清體積

（6）加入0.1倍體積的ETR buffer,上下顛倒10次充分混勻

（7）冰上孵育10min，期間顛倒混勻數(shù)次

（8）42°C水浴5min，液體渾濁

（9）25°C 12000r離心3min,ETR在底部分層為藍色

（10）將上清轉移至一個新的2mlEP管中，加入0.5倍體積無水乙醇。輕柔顛倒6-7次，常溫靜置1-2min

（11）將膠回收柱子放在2ml收集管中，加入700ul第10步的液體到柱子中，12000rpm離心1min，棄掉液體

（12）重復11

（13）加入500ul HBC Buffer（HBC Buffer使用前用異丙醇稀釋）

（14）離心，棄掉液體

（15）加入700ul DNA Wash Buffer（DNA Wash Buffer使用前加入無水乙醇）

（16）離心，棄掉液體

（17）重復15-16步驟

（18）離心2min，轉移至1.5ml EP管，烘干。

（19）加入80-100ul Elution Buffer，常溫靜置1min，12000r離心1min獲得質粒DNA。