動物行為學(xué)實驗寶典｜學(xué)習(xí)記憶系列之水迷宮實驗方法
一、學(xué)習(xí)與記憶
學(xué)習(xí)是高等生物接受外界環(huán)境變化獲得新行為和經(jīng)驗的過程，常見的學(xué)習(xí)形式有非聯(lián)合型學(xué)習(xí)和聯(lián)合型學(xué)習(xí)兩種。人或動物受到一次或多次單一刺激后形成的、并不需要將兩個以上刺激或刺激與反應(yīng)之間形成明確聯(lián)系的過程，如習(xí)慣化（習(xí)以為常），稱為非聯(lián)合型學(xué)習(xí)；人或動物受到一系列事物刺激、且在時間上很靠近地重復(fù)發(fā)生,最后在腦內(nèi)逐漸形成聯(lián)系，如操作性條件反射，稱為聯(lián)合型學(xué)習(xí)。
記憶是對學(xué)習(xí)獲得的經(jīng)驗或行為的保持，包括獲得、鞏固、再現(xiàn)及再鞏固四個環(huán)節(jié)，常見的有程序性記憶與陳述性記憶。程序性記憶即無意識情況下建立的無法用語言描述的記憶，如使用筷子；陳述性記憶指可以用語言描述的關(guān)于過去經(jīng)歷或事件的記憶，包括事實、事件、情景以及他們間的相互關(guān)系等，如回憶并說出事情經(jīng)過。
學(xué)習(xí)與記憶二者是互相聯(lián)系的神經(jīng)活動過程，學(xué)習(xí)過程中必然包含記憶，記憶也總是需要以學(xué)習(xí)為先決條件。以實驗動物為對象，采集并分析動物的行為信息是學(xué)習(xí)與記憶的常規(guī)研究手段之一。例如：利用動物自發(fā)活動特性進行研究、通過獎懲等操縱進行研究等。今天我們主要介紹利用動物自發(fā)活動進行研究的最常用手段之一：Morris水迷宮中的平臺探查實驗研究方法（常規(guī)的水迷宮實驗包括Morris水迷宮、通道式水迷宮等，由于Morris水迷宮最常用，本文主要介紹Morris水迷宮）。后續(xù)我們還會介紹：T/Y迷宮、放射性迷宮（八臂迷宮）、物體識別（新物體識別、位置物體識別）、操作性條件反射（斯金納箱）、穿梭箱、跳臺、避暗箱、巴恩斯迷宮等。
二、實驗方法步驟
2.1 原理
1981年，Morris基于動物厭惡水環(huán)境的特性建立了水迷宮方法，實驗動物被迫游泳，學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中的平臺。通過記錄實驗動物在目標(biāo)象限（原先放置平臺的象限）所花的時間和進入該象限的次數(shù)，以此作為空間記憶的檢測指標(biāo)。
2.2 文獻
Partial loss of psychiatric risk gene Mir137 in mice causes repetitive behavior and impairs sociability and learning via increased Pde10a.
2.3 實驗設(shè)備
Morris水迷宮、VisuTrack V2.0軟件、攝像系統(tǒng)等。
2.4 實驗方法
2.4.1 常用實驗分組方法
1、已知品系的記憶缺陷轉(zhuǎn)基因動物模型
(1)對照組：按照實際實驗需求選定（分類一：工具鼠的空載鼠，如Cre、Cas9、FLP鼠等；分類二：同籠陰性鼠、轉(zhuǎn)基因品系背景鼠等）
(2)轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M：不作任何處理的轉(zhuǎn)基因動物
(3)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灲M：對轉(zhuǎn)基因動物進行額外處理，如給藥，注射病毒等
2、定向基因編輯待驗證的轉(zhuǎn)基因動物
(1)對照組：按照實際實驗需求選定。（分類一：工具鼠的空載鼠，如Cre、Cas9、FLP鼠等；分類二：同籠陰性鼠、轉(zhuǎn)基因品系背景鼠等）
(2)轉(zhuǎn)基因組：不作任何處理的轉(zhuǎn)基因動物
3、驗證藥物造模效果-學(xué)習(xí)記憶變強/變?nèi)?/strong>
(1)對照組：不作任何處理的動物
(2)實驗組：使用造模藥物使動物學(xué)習(xí)記憶能力變化的動物
4、驗證受試藥物對造模藥物的恢復(fù)效果
(1)對照組：不作任何處理的動物
(2)藥物造模組：使用造模藥物使動物出現(xiàn)記憶力問題的動物
(3)實驗組：對藥物造模組動物使用受試藥物恢復(fù)的動物
*所有實驗動物均進行同樣的實驗流程，在實驗開始就應(yīng)對需要給藥的動物進行給藥
2.4.2 適應(yīng)階段
實驗開始前3-7天（自己繁育小鼠 Handle 3天，外購動物 Handle 7天），每天抓取、輕撫動物，讓其熟悉實驗人員手，在實驗過程中不會處于應(yīng)激狀態(tài)。
2.4.3 學(xué)習(xí)階段
1、旗幟標(biāo)記學(xué)習(xí)(1)實驗設(shè)置
在迷宮臂交叉垂直的四個方向的水面上方分別放置一個顯眼（與水面，窗簾的顏色不同）的標(biāo)志物（如圓形，方形，五角星，三角形等）可以貼在桶臂上，也可以貼在簾子上（需避免簾子在實驗過程中晃動），或者房間墻壁上（此時需要沒有簾子）
將水面按照標(biāo)記物的位置分為4個象限，并將平臺放置于一個象限的中心
將平臺置于水下1-2厘米深（加入染料后，根據(jù)動物游泳過程中水面波動后，水平臺不會露出水面即可）。不宜太深，平臺過深會導(dǎo)致動物到達平臺后仍然繼續(xù)游走
在平臺上放置一個高于水面的標(biāo)記物，使動物可以通過標(biāo)記物確認(rèn)平臺位置
(2)時間
根據(jù)動物學(xué)習(xí)記憶水平，可設(shè)置0-6天的學(xué)習(xí)時間
(3)方法
將動物分別從不同象限放入水中，讓動物自由活動尋找平臺。
動物找到平臺：記錄時間，讓動物在平臺停留30s，觀察周圍環(huán)境
動物未找到平臺：動物自由活動1-2min（實驗中保持一致，推薦1min）后， 將動物引導(dǎo)至平臺所在處，并停留30s，讓動物觀察周圍環(huán)境
每只動物每天分別隨機從4個象限各進行一次實驗，兩次實驗需要間隔至少2-3min（推薦2min），讓動物補充體力。（方法一：兩只動物同時開展實驗，交替進行學(xué)習(xí)，即動物A進行Trial1，接下來動物B進行Trial1，動物A進行Trial2依次進行實驗。方法二：單只動物進行4個Trial實驗后，再開展另外一只動物訓(xùn)練實驗。）
(4)記錄數(shù)據(jù)
第一次到達平臺的時間（潛伏期），總活動軌跡、距離。
總活動軌跡用于判斷動物是否有不利于實驗結(jié)果的行為習(xí)慣（如繞圈，跳躍等），必要時以此剔除動物
總活動距離僅做動物活躍程度參考，受潛伏期以及動物活躍程度影響
潛伏期越短說明動物已經(jīng)學(xué)會找到平臺這一行為，學(xué)習(xí)能力越強
2、平臺學(xué)習(xí)
(1)實驗設(shè)置：取下平臺上高于水面的標(biāo)記物，其余保持不變
(2)時間：根據(jù)動物學(xué)習(xí)記憶水平，可設(shè)置4-7天的學(xué)習(xí)時間
(3)方法：
將動物分別從不同象限放入水中，讓動物自由活動尋找平臺。
動物找到平臺：記錄時間，讓動物在平臺停留30s，觀察周圍環(huán)境
動物未找到平臺：動物自由活動1-2min（實驗中保持一致，推薦1min）后， 將動物引導(dǎo)至平臺所在處，并停留30s，讓動物觀察周圍環(huán)境
每只動物每天分別隨機從4個象限各進行一次實驗，兩次實驗需要間隔至少2-3min（推薦2min），讓動物補充體力
(4)記錄數(shù)據(jù)：第一次到達平臺的時間（潛伏期），總活動軌跡、距離
總活動軌跡用于判斷動物是否有不良行為習(xí)慣（如繞圈，跳躍等），必要時以此剔除動物
總活動距離僅做動物活躍程度參考，受潛伏期以及動物活躍程度影響
潛伏期越短說明動物已經(jīng)學(xué)會找到平臺這一行為，學(xué)習(xí)能力越強
2.4.4 測試階段
1、實驗設(shè)置
去除水中的平臺，其余保持不變
2、時間
平臺學(xué)習(xí)結(jié)束后一天
3、方法
將動物在指定位置放入水迷宮中，讓動物在水中自由活動1-2min（推薦1min，與學(xué)習(xí)階段測試時間相同）
4、記錄數(shù)據(jù)
主要包括：平臺區(qū)域經(jīng)過次數(shù)、平臺區(qū)域停留時間、總活動軌跡與距離、不同象限活動時間、距離。
(1)經(jīng)過平臺區(qū)域次數(shù)為主要指標(biāo)，經(jīng)過次數(shù)越多，說明動物記憶越好
(2)平臺區(qū)域停留時間作為經(jīng)過平臺次數(shù)的參考，部分動物可能會在平臺區(qū)域停留，導(dǎo)致經(jīng)過平臺區(qū)域次數(shù)較少
(3)總活動軌跡可以作為實驗結(jié)果進行展示
(4)當(dāng)經(jīng)過平臺次數(shù)，停留時間無顯著差異時，考慮分析平臺所在象限的活動時間及距離是否有差異，部分動物可能對平臺具體位置記憶不是特別清楚，但是會在平臺附近區(qū)域反復(fù)移動
2.4.5 數(shù)據(jù)分析
1、不同時期分析的數(shù)據(jù)類型不同
2、采用單因素方差分析（one way-ANOVA），當(dāng)多組間有差異時，兩兩比較采用Fisher's LSD post hoc多重比較方法
3、P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異
1、實驗時，建議將水溫維持在21℃-23℃范圍內(nèi)。水溫過低或過高均容易導(dǎo)致動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。
2、實驗時間周期設(shè)置應(yīng)保證對照組對照組的動物學(xué)會的最短時間為標(biāo)準(zhǔn)，實驗周期過長會讓學(xué)會尋找平臺的動物產(chǎn)生厭倦感，從而影響實驗結(jié)果。
3、每次實驗結(jié)束后，需要將動物毛發(fā)擦干，避免動物受涼死亡。
4、實驗中需要在水中加入不易變質(zhì)的染料，不僅可以增加水面與動物顏色的對比度，也可以防止動物透過透明的水看到平臺。黑鼠棕鼠推薦使用鈦白粉做為染料；白鼠推薦使用食用黑色素作為染料。染料購買可以咨詢上海欣軟工作人員。
另外還可選擇使用透明浮珠，其有反射少、蒸發(fā)少等特點，但是阻力大，會導(dǎo)致小鼠游泳非常累，因此不推薦。
5、實驗進行過程中不要進行換水。雖然水池中會存在很多動物排泄物導(dǎo)致異味產(chǎn)生，但換水操作可能會導(dǎo)致動物認(rèn)為進入了一個新的環(huán)境而影響實驗結(jié)果。
6、加入的染料易在水中沉降，每半天進行實驗前應(yīng)對水進行攪拌，使染料重新分布均勻。
7、實驗過程中每天都會有水的損耗，導(dǎo)致平臺深度越來越淺。建議實驗開始前確定一個標(biāo)準(zhǔn)水位，后續(xù)每天進行實驗前，對迷宮進行補水。
8、實驗過程中應(yīng)盡可能保持安靜，避免聲音影響動物對方向的判斷。
9、實驗人員將鼠放入水迷宮后，應(yīng)盡快離開動物視線區(qū)域以及視頻記錄區(qū)域，避免被動物當(dāng)做標(biāo)記物，或被視頻記錄識別為實驗動物。
10、固定時間點開展實驗。由于動物節(jié)律問題，在一天不同的時間段進行實驗會導(dǎo)致實驗結(jié)果不同。建議實驗過程中，不同實驗組的動物逐只或逐2只進行實驗，可以獲得更為準(zhǔn)確的實驗結(jié)果。
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