MS-MS是在一級質譜的基礎上選擇有意義的肽段離子繼續(xù)進行二級質譜分析，即將待測樣品進行兩次連續(xù)的質譜分析，通常通過串聯(lián)質譜儀來完成，如三重四極桿質譜儀（TQMS或QqQ）、混合三重質譜儀四極-阱質譜（Quadrupole Trap MS）以及混合線性離子阱軌道質譜等。

質譜技術主要是鑒定蛋白的相對分子質量，通過與其他技術如色譜技術相結合可以實現其他理化性質的表征，如蛋白質氨基酸組成序列、含量、濃度、純度、翻譯后修飾方式以及蛋白與蛋白相互作用等。高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術（HPLC-MS-MS）是分析蛋白質含量和純度的重要質譜技術，MS-MS將兩個質譜儀耦合聯(lián)用，在兩個四級桿中間加入碰撞反應池，以裂解經過第一個四級桿篩選后的前體/母離子產生碎片/子離子，二級質譜將一級質譜打碎的離子在打碎一次，將m/z相同的碎片進行進一步甄別，可以得到更豐富的樣品信息，具有良好的可重復性、分辨率和靈敏性，提高了檢測結果的準確性。