熒光素酶-活體成像實驗常見問題盤點～
熒光素酶（Luciferase）是自然界中能夠產生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是來自北美螢火蟲體內的熒光素酶(Firefly?Luciferase)。螢火蟲熒光素酶屬于加氧酶，其發(fā)光反應需要O2和Mg2+參與；有輔酶A存在時能提高反應效率，增加發(fā)光時間。螢火蟲熒光素酶無需翻譯后修飾，即可表現出熒光素酶活性。
活體成像技術原理：
將熒光素酶編碼序列通過遞送工具遞送至目的細胞或組織內表達熒光素酶，當外源（腹腔或靜脈注射）給予相應底物，即可在幾分鐘內產生發(fā)光現象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內才會產生發(fā)光現象，并且光的強度與標記細胞的數目線性相關。
底物給藥方式及特點：
常用的底物給藥方式有腹腔注射和尾靜脈注射。
腹腔注射（常用）：迅速分布全身，并穿過包括大腦在內的血液組織屏障；注射底物 10～20 分鐘后，發(fā)光信號達到峰值；
尾靜脈注射：可提供更好的再現性和 5～10 倍的高信號，但是注射難度較高，代謝快。
建議：第一次使用熒光素酶底物成像，或者更換新品牌底物，需要進行預實驗，觀察底物在何時達到峰值。確定注射熒光素底物和成像之間的最佳延遲，然后將此時間用于所有實驗，以標準化成像數據。
常見問題
Q：熒光素酶的發(fā)光是否需要激發(fā)光？
A：熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素（Luciferin）。
Q：底物熒光素（Luciferin）是如何進入小鼠體內的？需要多少？
A：熒光素一般通過腹腔注射或尾部靜脈注射進入小鼠體內的。常用方法是腹腔注射，擴散較慢，開始發(fā)光慢，持續(xù)發(fā)光長。若進行熒光素靜脈注射，擴散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時間很短。大部分文獻中，熒光素的濃度是150mg/kg。20g的小鼠約需3mg的熒光素（具體可參考相應文獻）。
Q：熒光素酶的發(fā)光特性如何？
A：通過腹腔注射老鼠后約一分鐘左右熒光素酶就開始發(fā)光，通常十分鐘后強度達到穩(wěn)定的最高點。在最高點通常持續(xù)約20-30分鐘后開始衰減，約三小時后發(fā)光全部消失。通常最好的檢測時間是在注射后15 - 35分鐘之間，建議實驗人員在做不同實驗模型前進行連續(xù)時間點發(fā)光曲線的繪制，以確定最高穩(wěn)值的時間范圍。
Q：有幾種常用的熒光素酶？特性如何？
A：常用的熒光素酶有兩種，分別是Luciferase和Renilla熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是D-luciferin，后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光顏色不一樣，前者所發(fā)的光波長在540-600nm，后者所發(fā)的光波長在460-540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內的代謝比前者快。
Q：正常成年小鼠可以看到體內發(fā)光嗎？是否需要裸鼠？
A：可以。成體老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的區(qū)別只在于對可見光的穿透性不同。
Q：熒光素酶的發(fā)光強度是否同細胞的數量成正比？
A：是的，熒光素酶的發(fā)光強度同標記的靶點，包括細胞、基因、細菌和病毒的數量成正比。有文獻顯示熒光素酶的發(fā)光強度與細胞數成正比關系，并且線性關系到0.9 以上。
Q:動物的皮膚和毛發(fā)是否會影響收集光信號的強弱？
A:會有一定的影響。例如，C57BL/6 小鼠毛發(fā)生長周期由三個階段組成：靜止期（皮膚為淡粉色）、生長期（皮膚變?yōu)樯罨疑蚝谏⒊墒炱冢l(fā)停止生長，皮膚恢復為淡粉色）。生長期中的皮膚色素沉著是活體成像中的一個重要變量，特別是當需要對小信號變化或動物之間的信號差異進行評估時，強烈著色的皮膚可導致 90% 以上的光信號衰減，這是可能導致實驗誤差的因素之一。此外，就算是處于靜止期或成熟期的小鼠，身上的毛發(fā)也會造成一個數量級的光信號衰減。建議：成像前一天，需要通過剃毛或化學脫毛來去除觀察區(qū)域的毛發(fā)，以便最大限度地收集信號。
