?細(xì)胞融合

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?在獲得兩個(gè)親本細(xì)胞以后需要對(duì)其融合，以獲得B淋巴細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞雜合體。細(xì)胞融合是指在自然或者人工條件下使得兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并為一個(gè)細(xì)胞的過程。雖然細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可能會(huì)自發(fā)融合，但是概率極低，因此需要借助外界誘導(dǎo)方法促進(jìn)細(xì)胞融合。

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?誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有生物法，化學(xué)法和物理法。

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?生物法：如紫外滅火的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合，其可以大大提高融合概率，在病毒類融合劑中最為有效，適用廣泛。

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?化學(xué)法：目前應(yīng)用廣泛的有聚乙二醇。其易得，簡(jiǎn)便，融合效果也穩(wěn)定。

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?物理法：電融合

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?雜交瘤細(xì)胞篩選

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?1）雜交瘤細(xì)胞選擇

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?細(xì)胞融合會(huì)產(chǎn)生三種融合細(xì)胞：B淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合體，骨髓瘤與骨髓瘤細(xì)胞融合體，第三種就是需要篩選出來的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤的雜合體。

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?采用HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，在該培養(yǎng)基中只有骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞的雜合體才能存活并無限增殖。為此，在接種96孔板培養(yǎng)時(shí)，加入一定量的HAT培養(yǎng)液，經(jīng)過1-2周的培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞被選擇培養(yǎng)出來。

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?2）特異性抗體篩選

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?初步篩選出來的雜交瘤細(xì)胞并不一定都能分泌特異性抗體，因此還需要進(jìn)一步對(duì)這些雜合體進(jìn)行篩選。目前實(shí)驗(yàn)室常用的是酶聯(lián)免疫法，也就是將抗原固相在微孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)上清一定時(shí)間后，用酶標(biāo)記的抗鼠二抗，通過酶促底物的顏色變化了解是否存在針對(duì)該抗原的特異性抗體。該方法簡(jiǎn)便易行且可大規(guī)模操作，所以目前實(shí)驗(yàn)室都廣泛采用此方法。

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雜交瘤細(xì)胞克隆建株

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?在細(xì)胞融合初期，雜交瘤細(xì)胞的染色體常有丟失的現(xiàn)象，甚至導(dǎo)致其喪失分泌特異性抗體的功能。因此，在篩選抗體陽性的雜交瘤細(xì)胞時(shí)，應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，以保持雜交瘤細(xì)胞具有同源的子代。常見的方法有很多，比如有限稀釋法（limiting dilution method）、軟瓊脂法（soft agar method）、單細(xì)胞顯微操作法（single cell micromanipulation method）和熒光激活細(xì)胞分類儀（fluorescence activated cell sorter）。

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?雜交瘤細(xì)胞一經(jīng)建立應(yīng)盡快凍存，保證雜交瘤細(xì)胞不會(huì)被污染或變異。因此，必須在得到分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞后的早期，保存幾批細(xì)胞于液氮中，以便在發(fā)生意外時(shí)可以將其復(fù)蘇，繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。