肺癌是致死率最高的癌癥類型，其中80%至85%的肺癌屬于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）亞型。PD-L1治療可以顯著提高NSCLC患者生存率，然而絕大部分NSCLC患者對(duì)PD-L1的單一藥物治療沒(méi)有反應(yīng)。在以往的研究中，都是以T細(xì)胞作為預(yù)測(cè)PD-L1免疫療法的預(yù)后標(biāo)志物，而Genentech公司的Romain Banchereau和David S. Shames領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)合bulk RNA-seq聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)漿細(xì)胞可以作為非小細(xì)胞肺癌中PD-L1抑制劑（阿替唑單抗）治療預(yù)后的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。其研究成果：“Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer”發(fā)表于Cancer Cell期刊。

研究材料

192名隨機(jī)II期臨床試驗(yàn)（POPLAR）中接受阿替唑單抗治療（n=96）或多西紫杉醇化療（n=96）患者的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）FFPE組織；

699名隨機(jī)III期臨床試驗(yàn)（OAK）中接受阿替唑單抗治療(n=350)或多西紫杉醇化療(n=349)患者的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）FFPE組織；

三個(gè)獨(dú)立的NSCLC患者單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集；

29例人非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織：轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)（mLN）、非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)（nLN）、正常癌旁組織（nLung）、腫瘤活檢（Tbio）和腫瘤切除（T res）。

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技術(shù)路線

步驟1：Bulk-RNA數(shù)據(jù)分析與阿替唑單抗治療的患者總體生存（OS）改善顯著相關(guān)的B細(xì)胞特征；

步驟2：通過(guò)對(duì)NSCLC樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq），識(shí)別腫瘤內(nèi)不同B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，并驗(yàn)證了分析結(jié)果；

步驟3：scRNA-seq聯(lián)合bulk-RNAseq分析目標(biāo)B細(xì)胞特征；

步驟4：確定高漿細(xì)胞特征與阿替唑單抗治療后的患者生存率的關(guān)系；

步驟5：確定漿細(xì)胞特征在具有三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(TLS)和/或淋巴聚集（LAs）的腫瘤中富集。

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研究結(jié)果

1. 阿替唑單抗治療患者的B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特征與患者生存率改善相關(guān)

為了探究阿替唑單抗治療患者的內(nèi)在特征與患者生存率的關(guān)系，研究者對(duì)OAK隨機(jī)III期臨床試驗(yàn)中接受阿替唑單抗治療后受益患者和無(wú)受益患者進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受益患者中與B細(xì)胞（漿細(xì)胞）相關(guān)的基因高表達(dá)，如CD79A、CD19等（圖1 A），然而在化療組中這些基因表達(dá)均不顯著（圖1 B），表明這些基因?qū)Π⑻孢騿慰怪委煹男Ч哂蓄A(yù)測(cè)價(jià)值。為了驗(yàn)證這一價(jià)值，研究者在OAK隨機(jī)III期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了生存分析，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞標(biāo)記物CD79A和CD19的高表達(dá)與IFNG或IFN誘導(dǎo)的趨化因子CXCL10相比，更顯著的改善了患者總體生存率（圖1 C-F）。

2. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)確定B細(xì)胞亞群表達(dá)特征

為了進(jìn)一步研究與阿替唑單抗治療相關(guān)的B細(xì)胞表達(dá)特征，研究者對(duì)44例NSCLC患者的肺和外周組織進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析共捕獲208506個(gè)細(xì)胞，確定了三個(gè)主要 B細(xì)胞亞群，包括濾泡B細(xì)胞、生發(fā)中心B細(xì)胞和漿細(xì)胞（圖2A）。濾泡B細(xì)胞高表達(dá)CD83、CD69、SELL和BANK1；漿細(xì)胞高表達(dá)多種免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄物（IGHG2、IGHGP和IGHA2）、MZB1、DERL3和XBP1；生發(fā)中心B細(xì)胞高表達(dá)HMGA1、AICDA和RGS13（圖2C）。在兩個(gè)獨(dú)立的NSCLC的scRNA-seq數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證了這三類細(xì)胞的存在（圖2D和2E），并使用CyTOF在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步證實(shí)了這三個(gè)B細(xì)胞亞群的存在。

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3.?高度特異性的漿細(xì)胞表達(dá)特征可用于bulk RNA-seq分析

為了探究scRNA-seq分析中確定的B細(xì)胞亞群表達(dá)特征是否可以預(yù)測(cè)阿替唑單抗治療或多西紫杉醇化療后的患者生存率（OS）。研究者首先通過(guò)基因共表達(dá)分析和層次聚類結(jié)果，發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析確定的B細(xì)胞亞群表達(dá)特征可以應(yīng)用于bulk RNA-seq數(shù)據(jù)分析（圖3 A）。又對(duì)23例NSCLC腫瘤組織進(jìn)行了配對(duì)的bulk RNA-seq和mIF分析（圖3 B），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNA-seq或mIF對(duì)漿細(xì)胞的定量具有高度相關(guān)性（圖3 C）；對(duì)樣本進(jìn)行二分后得到了相似的分層（圖3D）。此外只有漿細(xì)胞的標(biāo)記基因與mIF漿細(xì)胞定量相關(guān)，而濾泡B細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞的標(biāo)記基因與mIF定量不相關(guān)。以上結(jié)果證明了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析確定的B細(xì)胞表達(dá)特征中的漿細(xì)胞具有高度特異性，并能應(yīng)用于bulk RNA-seq來(lái)對(duì)樣本進(jìn)一步分層。

4. 高漿細(xì)胞特征預(yù)測(cè)阿替唑單抗治療后的患者生存率增加

然后，研究者使用三分位數(shù)對(duì)患者進(jìn)行二分類，通過(guò)Kaplan-Meier對(duì)T3類和T1/2類進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然阿替唑單抗在三個(gè)B細(xì)胞特征中都觀察到OS改善的趨勢(shì)，但只有漿細(xì)胞信號(hào)顯著（圖4A-4D）；并且無(wú)論是生發(fā)中心B細(xì)胞、濾泡B細(xì)胞，還是tGE8特征（IFNG、 CXCL9、CD8A、GZMA、GZMB、CXCL10、PRF1和TBX21），都在這些模型中不顯著（圖4E）。

為了進(jìn)一步評(píng)估漿細(xì)胞特征對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)價(jià)值和獨(dú)立性，研究者對(duì)207名患者（阿替唑單抗 n=99；多西紫杉醇 n=108）采用PD-L1 IHC、RNA-seq和組織TMB進(jìn)行了全面的生物標(biāo)記物分析，并與多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析相結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，漿細(xì)胞特征對(duì)阿替唑單抗治療組中的OS有最強(qiáng)的影響，且高漿細(xì)胞特征的腫瘤患者僅在阿替唑單抗治療組中臨床獲益率顯著增加（圖4H），而在多西紫杉醇化療組中沒(méi)有這些相關(guān)性，這突出了漿細(xì)胞特征的特異性（圖4F）。

5. 漿細(xì)胞特征在具有三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(TLS)和/或淋巴聚集（LAs）的腫瘤中富集

前人在TLS中發(fā)現(xiàn)了腫瘤內(nèi)B細(xì)胞。因此，研究者評(píng)估了基線腫瘤H＆E玻片中TLS或淋巴聚集物（LAs）的存在情況，并通過(guò)RNA-seq和mIF比較TLSs和LAs在細(xì)胞表型水平上的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLS以CD20+ B細(xì)胞為主的獨(dú)特生發(fā)中心為標(biāo)志，其中生發(fā)中心被CD20+ B細(xì)胞和CD3+ T細(xì)胞的混合物包圍（圖5A）。此外，所有已識(shí)別的TLS均由鄰近的漿細(xì)胞標(biāo)記，并在LAs內(nèi)或周圍也發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞（圖5A）。為了進(jìn)一步探究漿細(xì)胞與其他細(xì)胞類型之間的關(guān)系，研究者進(jìn)行了mIF實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明漿細(xì)胞浸潤(rùn)可能與TLS或LAs中的T細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。

研究者又進(jìn)一步探究在POPLAR隨機(jī)II期臨床試驗(yàn)中腫瘤的H&E玻片是否存在TLS和/或LAs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在254例患者樣本中，9%的患者有TLS樣結(jié)構(gòu)，21%的患者有LAs；并發(fā)現(xiàn)含有TLS和/或LAs的腫瘤患者在使用阿替唑單抗治療時(shí)，OS有顯著增加，但使用多西紫杉醇化療時(shí)沒(méi)有顯著區(qū)別（圖5C）。這表明TLS和/或LAs的存在與阿替唑治療（而非多西紫杉醇化療）患者的OS獲益密切相關(guān)，這一特征與漿細(xì)胞特征相似。研究者又對(duì)TLS/LA+和TLS/LA-的腫瘤組織進(jìn)行了DE-Gs分析，發(fā)現(xiàn)含有TLS和/或LAs的腫瘤中三種瘤內(nèi)B細(xì)胞亞群的基因高度富集，尤其是漿細(xì)胞基因，包括MZB1、TNFRSF17（BCMA）和免疫球蛋白（圖6A和6B）。對(duì)三種B細(xì)胞特征的定量分析證實(shí)了TLS和/或LAs的腫瘤中漿細(xì)胞數(shù)量增加（圖6C）。

小編小結(jié)

總的來(lái)說(shuō)，該研究整合了阿替唑單抗免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療與多西紫杉醇化療兩個(gè)大型隨機(jī)臨床試驗(yàn)的bulk RNA-seq隊(duì)列，以及scRNA-seq和蛋白質(zhì)測(cè)量實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，NSCLC中高水平的瘤內(nèi)漿細(xì)胞與接受阿替唑單抗治療的患者更長(zhǎng)的OS密切相關(guān)，可以作為一種新的免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的預(yù)后標(biāo)志物。