2023.7.12，下午17.30

乳腺科脂肪，患者51歲

使用的膠原酶：膠原酶Ⅰ型（品牌：yeasen，cat：40507ES60，LOT:C1309010），用α-MEM培養(yǎng)基配制1%的膠原酶，－20℃避光保存

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取得標本后，冰上保存，盡快處理

用pbs+1%雙抗在皿中剪碎，去除筋膜和血管（2遍）

裝入50mlEP管，加入pbs+1%雙抗，500轉，5min（2遍，第2遍時將脂肪進一步剪碎成糊狀）

獲得約25ml脂肪

加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶（即25ml）

37℃，搖床，150轉速，消化2h

用等量完全培養(yǎng)基終止消化（即50ml）

1500轉，15min離心

可見上層有未消化完的脂肪和黃色的油脂，用巴氏管吸除

下層液體重懸后，70um濾網過濾

獲得的液體1500轉，10min離心

棄上清，底部留5-10ml

加入培養(yǎng)基重懸，轉移到15mlEP管中

1500轉，5min離心

棄全部上清

加入5mlRBC裂解液，重懸

放入細胞培養(yǎng)箱孵育5min

取出，加入5mlpbs重懸

1200轉，5min離心

可見底部沉淀已經變白（紅細胞已經去除）

加入10ml培養(yǎng)基重懸

1200轉，5min離心

棄全部上清

用培養(yǎng)基重懸后接種至6孔板

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另貼壁法：脂肪組織清洗干凈后，剪碎，組織塊均勻地鋪在培養(yǎng)皿中

盡量吸干凈水分

培養(yǎng)箱放置2h后再加入α-MEM培養(yǎng)基（含20%FPS）

回顧：

1.消化時完全可以分2個管，本次用1個管（25ml脂肪+25ml膠原酶）比較擁擠，感覺搖床時震蕩不充分

2.之前取得的乳腺科脂肪可能是取錯位置了，一半都是筋膜，或者腺體，不像脂肪。本次樣本明顯大部分是脂肪，去筋膜和血管僅損失了1/5的體積

3.清洗后共30ml體積的脂肪，其中5ml用于貼壁法，6個100mm圓皿，剩余的25ml用于消化法，接種在6孔板的6個孔中

4.P0代全部用20%FPS的α-MEM培養(yǎng)