骨髓間充質(zhì)干細胞成脂誘導分化

1.1 接種干細胞

取對數(shù)生長期的細胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的細胞密度接種至培養(yǎng)器皿，于37°C,5%?CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至匯合度90~100%，棄掉上清，加入成脂誘導分化培養(yǎng)基誘導液。NOTE:如細胞貼壁性較差，建議使用0.1%明膠對培養(yǎng)底面進行包被。

1.2 細胞分化誘導

于37°C, 5%?CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約3天，更換為成脂誘導分化培養(yǎng)基維持液，培養(yǎng)1天后，再更換為成脂誘導分化培養(yǎng)基誘導液，繼續(xù)培養(yǎng)3天。按照以上換液頻率誘導14~21天,并注意觀察細胞形態(tài)變化。根據(jù)細胞誘導形成的脂滴數(shù)量和大小，決定終止細胞誘導的時間，并進行染色鑒定。

2. 染色鑒定

2.1 細胞固定

吸去培養(yǎng)基使用適量1xPBS清洗一次,棄去后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面,室溫固定30~60min,棄去固定液再使用1xPBS清洗兩次。

2.2 油紅0染色

取生理鹽水或1xPBS與油紅O原液配制油紅0工作液(油紅0原液:生理鹽水=3:2)，現(xiàn)用現(xiàn)配。配制后可對油紅0工作液進行離心，以沉淀染色液中的過飽和析出物。向清洗干凈的誘導孔內(nèi)加入適量油紅0工作液,靜置染色30min。吸走油紅0工作液，用1xPBS清洗兩次，并加入適量1xPBS避免細胞干燥。

2.3 誘導評估

顯微鏡下觀察成脂染色效果，并進行圖像采集和誘導評估。誘導成功時，脂滴與油紅0染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。NOTE:干細胞的成脂分化水平因細胞類型、細胞供體來源，培養(yǎng)條件、細胞代次、細胞狀態(tài)和分化時間等因素而異。

骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨誘導分化?(平面誘導)

1. 細胞分化誘導

將對數(shù)生長期的細胞消化下來計數(shù)，成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘導液重懸細胞，離心后調(diào)整細胞密度密度1.0~2.0x 10e7cells/mL。吸取20?μl細胞懸液(約2.0~4.0x 10e5個細胞)懸滴至24孔板中央。置于37°C， 5%?CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)2~3 h使細胞貼壁。2~3 h后補充1 mL成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘導液正常培養(yǎng)。每隔2~3天換液一次。按照以上換液頻率誘導21~28天，并注意觀察細胞形態(tài)變化。

2. 染色鑒定

2.1 細胞固定

吸去培養(yǎng)基使用適量1xPBS清洗一次,棄去.后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面，室溫固定30~60min后，棄去固定液再使用1xPBS清洗兩次。

2.2 阿利辛藍染色

向清洗干凈的誘導孔內(nèi)加入適量染色液，避光靜置染色30min。吸去阿利辛藍染色液，用1xPBS清洗兩次,并加入適量1xPBS避免細胞干燥。

2.3 誘導評估

顯微鏡下觀察成軟骨染色效果，并進行圖像采集和誘導評估。誘導成功時，軟骨組織中的內(nèi)酸性粘多糖可被阿利辛藍染成藍綠色。

成軟骨誘導分化操作(三維誘導)

1. 干細胞的準備

將對數(shù)生長期的細胞消化下來計數(shù)，取3x 10e5個細胞轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，250g離心4 min。棄上清,加入0.5 mL成軟骨誘導分化培養(yǎng)基預混液，重懸細胞，150g 離心5min。小心棄去.上清，加入0.5 mL成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘導.液，重懸細胞，150 g離心5 min。將15 mL離心管的管蓋稍稍旋開，放置于37°C，5%?CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)。

2. 細胞分化誘導

24h后觀察細胞沉淀形變團聚的情況，如有明顯的變化，則小心輕柔地撥動管底，嘗試讓細胞團脫離管底，全部浸潤在誘導液中。

置于37°C, 5%?CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約21天，通常每2天更換一次新鮮配制的成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘導液。注意觀察細胞團成球情況及表面光滑度，決定終止細胞誘導的時間，并進行染色鑒定。

3. 染色鑒定

3.1 軟骨球固定

將軟骨球從離心管中轉(zhuǎn)移至EP管,并使用1xPBS清洗兩次，最后置于適量的4%中性甲醛溶液中。

3.2 石蠟包埋切片

軟骨球經(jīng)石蠟包埋后切片。

3.3 阿利辛藍染色

將石蠟切片脫蠟和脫水，使用阿利辛藍染色液染色30 min，用自來水沖洗2 min,蒸餾水沖洗1次。

3.4 誘導評估

顯微鏡下觀察成軟骨染色效果，并進行圖像采集和誘導評估。誘導成功時，軟骨組織中的內(nèi)酸性粘多糖可被阿利辛藍染成藍綠色。

NOTE:干細胞的成軟骨分化水平因細胞類型、細胞供體來源，培養(yǎng)條件、細胞代次、細胞狀態(tài)和分化時間等因素而異

骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化

1.1 明膠包被培養(yǎng)器皿

干細胞培養(yǎng)較長時間后，可能會出現(xiàn)脫壁卷邊或漂浮現(xiàn)象，建議使用0.1%明膠溶液對培養(yǎng)器皿進行包被。準備合適的培養(yǎng)器皿，取適量明膠覆蓋底面37°C靜置30 min,吸取晾干即可使用。

1.2 接種干細胞

取對數(shù)生長期的細胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的細胞密度接種至包被后的培養(yǎng)器皿中,于37°C，5%?CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至匯合度60~70%，棄掉上清，加入成骨誘導分化培養(yǎng)基。

1.3 細胞分化誘導

于37°C, 5%?CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約14~21天，每2~3天換液一次，并注意觀察細胞形態(tài)變化。根據(jù)細胞鈣鹽結(jié)晶析出和鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況,決定終止細胞誘導的時間，并進行染色鑒定。

2. 染色鑒定

2.1 細胞固定

吸去培養(yǎng)基使用適量1xPBS清洗一次，棄去后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面，室溫固定30~ 60 min,棄去固定液再使用1xPBS清洗兩次。

2.2 茜素紅染色

加入適量茜素紅染色液染3~5 min,吸走茜素紅染色液，用1xPBS清洗兩次，并加入適量1xPBS避免細胞干燥。

2.3 誘導評估

顯微鏡下觀察成骨染色效果，并進行圖像采集和誘導評估。誘導成功時，鈣質(zhì)結(jié)節(jié)與茜素紅染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。

NOTE:干細胞的成骨分化水平因細胞類型、細胞供體來源，培養(yǎng)條件、細胞代次、細胞狀態(tài)和分化時間等因素而異。

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細胞基因敲除

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