2022年7月,南京林業(yè)大學林學院林業(yè)遺傳與生物技術教育部重點實驗室在Frontiers in plant science（IF：6.627）期刊發(fā)表了題為“Transcriptome and Metabolome Analyses Reveal Differences in Terpenoid and Flavonoid Biosynthesis in Cryptomeria fortunei Needles Across Different Seasons”的文章，運用轉(zhuǎn)錄組學、雙平臺代謝組學技術闡述對季節(jié)性變化引起的柳杉（Cryptomeria fortunei）針葉代謝和轉(zhuǎn)錄組學變化的理解，為柳杉的適應機制及其代謝物的提取提供了參考，以揭示季節(jié)間柳杉針葉代謝反應的分子調(diào)控。

中文標題：轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析揭示不同季節(jié)柳杉針中萜類和類黃酮生物合成的差異

研究對象：柳杉針葉

發(fā)表期刊：Frontiers in plant science

影響因子：6.627

發(fā)表時間：2022年7月

運用生物技術：非靶向代謝組學、轉(zhuǎn)錄組學

背景介紹

柳杉（Cryptomeria fortunei）是我國特有樹種，生長迅速，木材特性優(yōu)良，是傳統(tǒng)藥材。類黃酮和萜類化合物是其主要的藥理成分，具有出色的解毒、抗氧化、抗真菌和殺蟲特性，已被用作植物保護、化妝品和制藥行業(yè)的原料。季節(jié)性變化（Seasonal changes，SCs）是全球環(huán)境變化的主要組成部分，日長、光照強度和溫度在年度周期中發(fā)生巨大變化。SC會引起樹木中代謝物和其他植物化學物質(zhì)的變化，并改變植物萜類化合物的產(chǎn)生、烯烴含量以及抗氧化和抗菌特性。

代謝物譜直接反映了植物的整體生理生化狀態(tài)，有利于研究植物的代謝過程，揭示植物對環(huán)境的適應性。轉(zhuǎn)錄組是一個物種產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄本的集合，可用于從整體水平研究基因功能和結(jié)構，揭示特定生物過程的分子機制。本研究綜合代謝組學和轉(zhuǎn)錄組學方法用于差異表達基因（differentially expressed unigenes，DEGs）和差異代謝物（differentially synthesized metabolites，DSMs）之間因果關系的共表達分析；結(jié)合生物學功能分析，闡明關鍵基因和代謝產(chǎn)物，進一步闡明植物在特定生理生態(tài)條件下的適應和調(diào)控機制。

技術流程

主要內(nèi)容

1.針葉的超微結(jié)構和生理指標有明顯變化

對針葉植物超微結(jié)構的觀察表明，不同季節(jié)針葉植物的結(jié)構存在明顯差異。夏季柳杉（SCC）葉綠體結(jié)構相對穩(wěn)定，圍繞在細胞內(nèi)表面，葉綠體基底層密集堆積；冬季柳杉（WCC）葉綠體結(jié)構輕微變形，類囊體結(jié)構松散，葉綠體基粒數(shù)量和堆積層數(shù)量較低（圖1G-L）。結(jié)果表明，WCC葉綠體結(jié)構的局部破壞降低了色素的含量，導致柳杉的不同形態(tài)表型。

圖1 |?與柳杉針葉季節(jié)變化相關的生理指標和針葉超微結(jié)構

2.代謝組學揭示了柳杉針葉在不同季節(jié)的代謝物變化

為進一步研究不同季節(jié)柳杉針葉的代謝差異，分別用GC-MS代謝組學和LC-MS代謝組學的雙平臺代謝組學分析了柳杉針葉的非靶代謝物。GC結(jié)果中多元統(tǒng)計分析準確地將所有樣品分為2個集群，反映了夏季和冬季針葉之間的明顯差異（圖2A-C）。共有63個DSMs在69條代謝途徑中被富集，包括23條重要的代謝途徑（圖2E）。與SCC結(jié)果相比，WCC針葉中上調(diào)的DSMs在檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）、乙醛酸和二羧酸代謝和賴氨酸降解中顯著富集（P < 0.05），下調(diào)的DSMs在氨基甲酸乙酯代謝中顯著富集（P < 0. 05），也可富集到氨基酸-tRNA生物合成、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成和半胱氨酸和蛋氨酸代謝等代謝通路。

LC結(jié)果中多元統(tǒng)計分析顯示，SCC和WCC針葉之間存在明顯差異（圖3A-C），共得到413個DSMs（圖3E）。在這些DSMs中，有44個DSMs富集于45條通路，包括11條重要的代謝通路（圖3F）。在WCC針葉中，上調(diào)的DSMs在類黃酮生物合成（FBP）、黃酮和黃酮醇生物合成和苯丙烷生物合成中顯著富集（P < 0.05），而下調(diào)的DSMs在植物激素信號轉(zhuǎn)導、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、酪氨酸代謝、磷酸戊糖、氰基氨基酸代謝和萜類生物合成（TBBP）途徑顯著富集（P < 0.05）。

圖2 |?基于氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）的差異代謝物（DSM）分析

圖3 | 基于液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）的差異代謝物（DSM）分析

3.柳杉轉(zhuǎn)錄組的富集分析

在WCC和SCC樣本之間共鑒定了14,057個DEGs（WCC針葉中上調(diào)6137個，下調(diào)7920個）（圖4A-B）。有5819個注釋了GO功能，最豐富的亞類是細胞，其次是細胞部分；生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）中被注釋最多的兩個亞類分別是細胞成分或生物發(fā)生和代謝過程；細胞和細胞部分；以及催化活性和結(jié)合（圖4C）。

為深入了解特定代謝物的合成、相關基因功能和多基因相互作用，作者對轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)進行了KEGG富集分析。下調(diào)的DEGs被注釋29條重要的（P < 0.05）途徑，光合作用（photosynthesis，PP）和光合作用-天線蛋白（photosynthesis-antenna proteins，PPP）是兩個最重要的途徑；光合生物的碳固定、黃銅類固醇生物合成和二萜類生物合成也被顯著富集（圖4D）。上調(diào)的DEGs被注釋為18條重要的（P < 0.05）途徑，其中真核生物的核糖體生物生成和類黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis，F(xiàn)BP）是兩條最重要的途徑（圖4E）。

圖4 |?差異表達的單基因（DEG）的功能分類

4.轉(zhuǎn)錄組和代謝組的綜合分析

為探索潛在的調(diào)控機制，作者對KEGG通路注釋的DEGs和DSMs進行Spearman相關分析。在排名前20位的基因中，14個與PP/PPP有關，3個與精氨酸生物合成和光合生物的碳固定有關，1個基因與MAPK信號傳導途徑-植物/FBP/RNA運輸有關。排名前20位的代謝物分別與FBP、TBBP、光合生物的碳固定以及淀粉和蔗糖、氨基酸和TCA/不飽和脂肪酸的生物合成/抗壞血酸和醛酸代謝有關。代謝物被明確分為兩類，I類（包括14種）和II類（其余6類）（圖5）。同一類別的代謝物是正相關的，不同類別的代謝物一般是負相關的（圖5）。因此，文章推測柳杉的季節(jié)性代謝差異主要與PP有關，其次是TBBP和FBP。

圖5 |?前20個差異表達的單基因（DEG）和差異合成代謝物（DSM）的相關性分析

5.與PP、TBBP和FBP相關的基因鑒定

代謝組學、轉(zhuǎn)錄組學聯(lián)合分析得知，不同季節(jié)柳杉針葉樣本在PP、TBBP和FBP成分的表達上有很大的不同。共有56個DEGs與PP有關，28個候選DEGs參與了TBBP，分別參與了單萜、雙萜、三萜、類胡蘿卜素、玉米素的生物合成。這些參與類固醇生物合成和二、三萜類途徑的基因，大部分在SCC針葉中被上調(diào)。37個DEGs與FBP有關，有12種代謝物對應也參與了FBP，12種代謝物中9種代謝物在WCC針葉中的含量對比于SCC針葉是上調(diào)的。

6.DEG表達的qRT-PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，實驗通過qRT-PCR測量了與光合作用、類黃酮生物合成和萜類化合物生物合成途徑選定有關的18個基因的轉(zhuǎn)錄水平。這些基因的表達模式與通過RNA-seq分析得到的結(jié)果相似（圖6）。這些結(jié)果為進一步研究柳杉針葉中參與光合作用、類黃酮和萜類化合物積累的關鍵基因提供了參考。

圖6 |?參與柳杉針葉中光合作用、類黃酮生物合成和萜類化合物生物合成途徑選定基因的qRT-PCR驗證

內(nèi)容總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)SC對P(P)P、TBBP、FBP影響較大。通過轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學聯(lián)合分析，結(jié)果中TBBP的MEP通路中的基因在SCC針葉中高表達，促進萜類化合物，尤其是二萜類化合物的積累；相反，與FBP相關的基因在WCC針葉中高表達，促進類黃酮積累。研究探討了SC對柳杉針葉代謝物的影響，提高了SC對植物組織中代謝物調(diào)節(jié)系統(tǒng)的理解。為提取植物代謝產(chǎn)物提供依據(jù)，也對富含萜類和黃酮類植物的遺傳改良提供重要參考。

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柳杉的代謝物含量在不同季節(jié)有所不同，該文章結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學、GC-MS非靶向代謝組學、LC-MS非靶向代謝組學分析，探討了不同季節(jié)間差異代謝物的生物合成機制，季節(jié)變化影響主要集中在光合作用途徑、萜類化合物、類黃酮生物合成途徑，為柳杉的適應機制及其代謝物的提取提供參考。

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（GC-MS非靶向代謝組學、LC-MS非靶向代謝組學）

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