2. 將配置好的分離膠加到已經(jīng)固定好的玻璃板間，等待其凝固。

3. 待分離膠凝固后，按照下表中的配方配置濃縮膠，將配置好的濃縮膠加到已經(jīng)固定好的玻璃板間，并插上梳子，等待其凝固。

將 HA-F 蛋白樣品以 3:1 體積比混合非變性 4×Buffer，混合均勻后加入上樣

孔中，80 V 電壓條件下進(jìn)行電泳 20 min，之后改為 100 V 條件至電泳結(jié)束；

3）凝膠電泳結(jié)束之后，使用凝膠染色液染色 25 min，隨后使用脫色液脫色 45 min。

待脫色完全之后使用 Tanon-5200 發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像記錄。

2.2.3.3 Western-Blot

HA-G 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞 48 h 后，于?6 孔板中加入細(xì)胞裂解液，離心收集上清，隨后進(jìn)行 6% Native-PAGE。待電泳結(jié)束后，將凝膠鋪于硝酸纖維素膜上并置于半干式電轉(zhuǎn)儀中，于 15 V 條件下轉(zhuǎn)膜 18 min。用 PBS 清洗載有蛋白的膜3 次后，將膜放入封閉液中，于 4 ℃封閉 12 h 后，PBST 洗滌 3 次，隨后加入1:10000 稀釋的抗 His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體，于室溫條件震蕩 1.5 h 后，PBST 洗滌3 次，緊接著加入 HRP 標(biāo)記的鼠二抗稀釋液，于室溫條件震蕩 45 min 后，PBST洗滌 3 次，最后進(jìn)行 ECL 顯色。

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WB結(jié)果好看的幾點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)

1、60V 3h；

2、HIS一抗特異性；

3、孵育一抗4°過(guò)夜，和封閉可以一起；

4、一抗清洗需要多次，時(shí)間盡量久點(diǎn)；

5、孵育二抗后，清洗盡量多次，時(shí)間久點(diǎn)；