JACS: 微流控水凝膠編碼技術(shù)用于單細(xì)胞中 5-羥甲基嘧啶差異可視化研究
? ? ? ?大家好，今天跟大家分享的是西安交通大學(xué)趙永席教授課題組于今年 1 月份發(fā)表在 JACS 上的文章，題目是“Differentiated Visualization of Single-Cell 5?Hydroxymethylpyrimidines with Microfluidic Hydrogel Encoding”。
? ? ??基因組中除了四個經(jīng)典堿基外，還包含化學(xué)修飾的DNA堿基。其中 5-甲基胞嘧啶及其氧化衍生物 5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）等已為人們熟知，而胸腺嘧啶的修飾及其生物學(xué)功能仍有待探究。5-羥甲基尿嘧啶（5hmU）是胸腺嘧啶的衍生物，由于其在細(xì)胞中含量低且與 5hmC 結(jié)構(gòu)相似，5hmU 的特異性識別和標(biāo)記以及單細(xì)胞中5hmU和5hmC的同時分析仍是挑戰(zhàn)。
? ? ? ?本文報道了一種微流控水凝膠編碼技術(shù)，可實現(xiàn)單細(xì)胞中5hmU和5hmC差異可視化。方法流程如圖 1所示。首先通過液滴微流控技術(shù)分散細(xì)胞，裂解后的單細(xì)胞及其基因組DNA包裹于單個瓊脂糖微凝膠中。然后對5hmU和 5hmC進(jìn)行標(biāo)記，先用硫代磷酸酯特異性標(biāo)記 5hmU，再用疊氮葡萄糖標(biāo)記 5hmC。標(biāo)記后的堿基通過化學(xué)交聯(lián)分別編碼到各自的DNA條碼引物中。原位擴(kuò)增反應(yīng)和熒光探針分子實現(xiàn)單細(xì)胞中5hmU和5hmC的可視化。最后利用機器學(xué)習(xí)算法對微凝膠中的5hmU/5hmC四維特征進(jìn)行解碼，實現(xiàn)非致瘤性、癌性和高侵襲性乳腺細(xì)胞株的區(qū)分。
? ? ? 作者首先證明了 5hmU 識別和標(biāo)記的特異性， 具體如下。首先LC-MS/MS測定T4噬菌體β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（T4β-GT） 標(biāo)記后分解的核苷， 結(jié)果如圖 2A所示，含有5hmU:A的dsDNA基本沒有糖基化5hmU核苷，而5hmU:G 和5hmC:G樣品標(biāo)記后生成大量糖基化核苷，證明T4β-GT能有效地將疊氮葡萄糖基轉(zhuǎn)移到5hmU:G中。接著通過 DNA 解鏈反應(yīng)和加入 SH-活性試劑（圖 2B），證明5hmU可被 5hmU DNA 激酶（5-HMUDK） 和腺苷-5-O-硫代三磷酸（ATP-γ-S） 特異性識別和標(biāo)記。
? ? ? 為了得到分散的單細(xì)胞并對 5hmU 進(jìn)行標(biāo)記，作者設(shè)計了一種兩股同流液滴芯片， 通過細(xì)胞懸浮流與熔融的瓊脂糖流合并，將單個細(xì)胞包裹進(jìn)瓊脂糖微凝膠中。實驗條件下，97%的positive液滴只含有一個細(xì)胞（圖 3A）。在瓊脂糖冷卻和凝膠化后，油相微凝膠被轉(zhuǎn)移到水相。微凝膠與 5-HMUDK 和 ATP-γ-S 孵育，標(biāo)記 5hmU為 5psmU， 5psmU與 5’端修飾的 DNA 引物反應(yīng)， 該引物可用于滾環(huán)放大（RCA） 反應(yīng)，產(chǎn)生長的單鏈 DNA 連環(huán)體。該連環(huán)體可捕獲多個熒光探針分子，用于信號放大（圖 3B）。單個細(xì)胞中 5hmU位點的數(shù)量可通過對微凝膠中的斑點進(jìn)行計數(shù)來粗略評估。
? ? ? 接下來 T4 β-GT 標(biāo)記 5hmC引入疊氮基團(tuán)，疊氮基團(tuán)與5′ DBCO 修飾的DNA引物交聯(lián)，然后進(jìn)行RCA反應(yīng)。選擇三種人乳腺上皮細(xì)胞系進(jìn)行實驗， 如圖 4 所示， 使用單個微凝膠的熒光強度來大致描述這兩種堿基在不同細(xì)胞系中的豐度。盡管存在顯著的單細(xì)胞異質(zhì)性，MCF-7的平均值均高于MCF-10A和MDA-MB-231。還進(jìn)行了兩個熒光通道的共定位分析，以研究 5hmU 和 5hmC在基因組DNA中的位置關(guān)系。在這些細(xì)胞系中觀察到不同且較高的共定位速率。
? ? ? 此外作者還嘗試通過5hmU和5hmC信號（熒光強度和斑點數(shù)）鑒別非腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞， 如圖 5 所示，常規(guī)方法難以區(qū)分三種細(xì)胞系。后利用深度學(xué)習(xí)自動編碼器、機器學(xué)習(xí)t-分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）和主成分分析（PCA）等降維算法，分別對二維空間中的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。如圖 5 所示， t-SNE 算法性能最優(yōu)，可區(qū)分三種細(xì)胞系。
? ? ? 綜上，作者首次使用硫代磷酸酯和DNA條碼技術(shù)對5hmU位點進(jìn)行了特異性標(biāo)記，并結(jié)合液滴微流控技術(shù)和DNA擴(kuò)增技術(shù)，實現(xiàn)了微凝膠包裹的單細(xì)胞中5hmU和5hmC的差異可視化分析。
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.9b11393。
