? ? ? ? circRNAs是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共價(jià)鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子。circRNA具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),區(qū)別于傳統(tǒng)的線性RNA，大量存在于真核轉(zhuǎn)錄組中。大部分的circRNA是由外顯子序列構(gòu)成，在不同的物種中具有保守性，同時(shí)存在組織及不同發(fā)育階段的表達(dá)特異性。

近年來有大量研究表明circRNA與疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，是目前研究熱點(diǎn)之一。然而由于circRNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特殊性，在構(gòu)建過表達(dá)和干擾載體的過程中會遇到諸多難點(diǎn)。先來說過表達(dá)，circRNA過表達(dá)難點(diǎn)可總結(jié)為這三點(diǎn)：（1）成環(huán)效率低：使用不同的促成環(huán)框架序列（Alu元件或反向互補(bǔ)序列），對于不同基因的過表達(dá)效率可能有差異，序列偏長或偏短的circRNA成環(huán)效率可能會偏低。（2）成環(huán)準(zhǔn)確率低：在插入的circRNA序列側(cè)翼使用促成環(huán)框架序列，這樣的載體過表達(dá)circRNA成環(huán)較容易，但不易在準(zhǔn)確的AG-GT位點(diǎn)處剪切成環(huán)。（3）特殊情況：對于特殊序列來源或非AG-GT剪切環(huán)化模式的circRNA，使用現(xiàn)有的載體無法實(shí)現(xiàn)高效成環(huán)。

為解決以上難題，漢恒生物研發(fā)了一款高效成環(huán)過表達(dá)載體系統(tǒng)：

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圖1漢恒HB circ-EnhancedTM circRNA環(huán)化系統(tǒng)

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該成環(huán)系統(tǒng)有以下幾個(gè)特點(diǎn)：

（1）人巨細(xì)胞病毒的CMV啟動子可以高效表達(dá)目的circRNA；

（2）上下游成環(huán)元件Front circ-signal和Back circ-signal可以高效促使表達(dá)的circRNA環(huán)化；

（3）線性化的載體非常方便目的circRNA直接無縫克隆，極大降低無關(guān)序列參與成環(huán)的幾率。

該載體可用來轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，高效表達(dá)circRNA并促使其高效成環(huán)。同時(shí)，漢恒生物也可提供病毒包裝服務(wù)，病毒載體見圖2。

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圖2漢恒HB circ-EnhancedTM circRNA研究工具載體系統(tǒng)

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接著來講講circRNA干擾。一般是針對circRNA的成環(huán)處設(shè)計(jì)多條siRNA序列，篩選可特異性干擾circRNA表達(dá)的序列，構(gòu)建shRNA病毒載體并包裝所需病毒。之所以針對成環(huán)處設(shè)計(jì)干擾序列，是因?yàn)檫@樣可避免干擾到線性宿主基因，以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中不會因線性化的宿主基因被錯(cuò)誤干擾導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變。

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circRNA過表達(dá)和干擾，漢恒生物可提供以下服務(wù)：

（1）circRNA過表達(dá)和干擾質(zhì)粒構(gòu)建；

（2）circRNA過表達(dá)和干擾慢病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒包裝；

（3）基于慢病毒技術(shù)的穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建服務(wù)；

（4）circRNA精確成環(huán)驗(yàn)證。

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