單克隆抗體制備原理：

抗體主要由B淋巴細(xì)胞合成。每個(gè)B淋巴細(xì)胞有合成一種抗體的遺傳基因。動(dòng)物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，含遺傳基因不同的B淋巴細(xì)胞可以合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受外界抗原刺激后，可誘發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，即單克隆抗體。B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進(jìn)行無限分裂；腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下可以無限傳代，是“永久”的細(xì)胞，但不能產(chǎn)生抗體。因此將骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)免疫過的小鼠的脾細(xì)胞在聚乙二醇等介導(dǎo)下發(fā)生融合，融合后的雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性，一方面可以分泌特定的抗體，另一方面也具備了腫瘤細(xì)胞無限增殖的能力，可在體外培養(yǎng)條件下或移植到體內(nèi)無限增殖，從而分泌大量單克隆抗體。

單克隆抗體制備流程：

1、免疫動(dòng)物

免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的過程。一般選用6-8周齡Balb/c健康雌性小鼠，按照預(yù)先指定的免疫方案進(jìn)行免疫注射。抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞。（抗血清制備——免疫動(dòng)物）

２、脾細(xì)胞的準(zhǔn)備

• 拉頸處死小鼠

• 無菌操作取出脾臟

• 清洗研磨，收集細(xì)胞

• 離心洗滌

• 細(xì)胞計(jì)數(shù)

３、骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備

• 收集細(xì)胞

• 離心洗滌

• 活細(xì)胞計(jì)數(shù)

• 調(diào)整細(xì)胞濃度

４、細(xì)胞融合

• 骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按一定比例混合1：10或1：5。

• 加入50% PEG促融劑（在PEG作用下B淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞）。

• 加入不完全培養(yǎng)液，終止PEG的融合作用，離心，棄上清。

?細(xì)胞融合注意事項(xiàng)

５、雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)

在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏HGPRT和TK，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡，未融合的B淋巴細(xì)胞雖具有HGPRT和TK，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有骨髓瘤細(xì)胞與免疫B細(xì)胞融合的雜交瘤既有骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的能力，又從免疫B細(xì)胞得到HGPRT和TK的基因產(chǎn)物，因此能在HAT選擇培養(yǎng)基中存活和繁殖。

• 在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3～4天后瘤細(xì)胞消失，可見外形似骨髓瘤細(xì)胞，渾圓透亮的雜交瘤細(xì)胞形成小集落。

• 觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待其布滿孔底1/10面積時(shí)，即可取培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體。

6、篩選分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞

雜交瘤細(xì)胞在融合后2周即可開始篩選抗體活性，通常根據(jù)所研究抗原的特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室的條件，選擇不同類型的方法。包括：免疫熒光法、放射免疫（RIA）法、組織化學(xué)法和酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法等，其中最常用的方法是ELISA法。

7、雜交瘤細(xì)胞克隆化

在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。克隆化——即把培養(yǎng)孔中的細(xì)胞從單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，使之成為單克隆，其分泌的抗體達(dá)到均一性。

8、單克隆抗體的大量制備

(1) 動(dòng)物體內(nèi)誘生法

• 取Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷或液體石蠟進(jìn)行預(yù)處理。

• 腹腔注射接種雜交瘤細(xì)胞。

• 約1～2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

(2) 體外培養(yǎng)法

• 體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。

• 從上清液中獲取單克隆抗體，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg/mL。

• 離心，去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得單克隆抗體。