逆轉錄合成cDNA

①非特異性逆轉錄：根據(jù)實驗需要，如果對全部RNA進行逆轉錄，則使用Takara公司生產(chǎn)的PrimeScriptTM?RT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒（Code No. RR036A）。按照說明書，在冰上配制10 ul反應液，裝于200?ul無酶PCR管內(nèi)，反應液體系如下：

非特異性逆轉錄反應體系

試劑? ? ??使用量

Total RNA? ? ??500 ng

5×PrimeScript?RT Master Mix（Perfect Real Time）? ? ??2 ul

RNase Free dH2O? ? ??補足至10 ul

反應液最多可配制成 20 ul體系，各試劑按比例相應增加。輕柔混勻，瞬時離心10?sec，該操作重復3次。在無酶PCR管上標注細胞名稱、PCR管編號等基本信息，打開PCR儀，進行逆轉錄反應，條件設置如下：

非特異性逆轉錄反應條件

溫度? ? ??時間

37℃? ? ??15 min（逆轉錄反應）

85℃? ? ??5?sec（逆轉錄酶的失活反應）

4℃? ? ??∞

反應完成后將PCR管取出，放置于冰上。如果進行Real Time?PCR反應，逆轉錄反應液可以根據(jù)實驗需要，用RNase Free dH2O稀釋2倍。如果暫時不使用，放于﹣80℃冰箱凍存。

②特異性逆轉錄：根據(jù)實驗需要，如果對特定RNA進行逆轉錄，則使用Takara公司生產(chǎn)的PrimeScriptTM?RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒（Code No. RR037A）。按照說明書，在冰上配制10 ul反應液，裝于200 ul無酶PCR管內(nèi)，反應液體系如下：

特異性逆轉錄反應體系

試劑? ? ??使用量

Gene?specific primer? ? ??0.5 ul

PrimeScript?RT Enzyme Mix I? ? ??0.5 ul

Total RNA? ? ??500 ng

5×PrimeScript?Buffer（for Real Time）? ? ??2 ul

RNase Free dH2O? ? ??補足至10 ul

反應液最多可配制成 20 ul體系，各試劑按比例相應增加。Gene specific primer由廣州銳博公司設計并合成，內(nèi)參為U6，由于該公司對其具有專利，故不予公開。輕柔混勻，瞬時離心10?sec，該操作重復3次。在無酶PCR管上標注細胞名稱、PCR管編號等基本信息，打開PCR儀，進行逆轉錄反應，條件設置如下：

特異性逆轉錄反應條件

溫度? ? ??時間

42℃? ? ??15 min（逆轉錄反應）

85℃? ? ??5?sec（逆轉錄酶的失活反應）

4℃? ? ??∞

?反應完成后將PCR管取出，放置于冰上。如果進行Real Time?PCR反應，逆轉錄反應液可以根據(jù)實驗需要，用RNase Free dH2O稀釋2倍。如果暫時不使用，放于﹣80℃冰箱凍存。

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