由于免疫本身與各種疾病都比較相關(guān)，所以不管是腫瘤還是非腫瘤疾病都可以做免疫浸潤(rùn)分析，只是非腫瘤生信中免疫浸潤(rùn)分析內(nèi)容相對(duì)簡(jiǎn)單一些。

面對(duì)這種發(fā)展趨勢(shì)，大神估計(jì)是花樣使用各種方法來(lái)做免疫浸潤(rùn)分析。對(duì)于生信小白，也不要著急，可以先多多了解一些免疫浸潤(rùn)分析小知識(shí)~?~

那生信里常用的免疫分析方法都有哪些呢？

小云總結(jié)了8種分析方法，一起來(lái)看看吧~?~

p?基于marker gene的ssGSEA富集分析的免疫分析方法

該方法將不同免疫細(xì)胞對(duì)應(yīng)的marker genes作為基因集合, 采用類似GSEA的算法來(lái)評(píng)估樣本中高表達(dá)的基因在不同免疫細(xì)胞的基因集合中是否富集。其代表性研究工具包括ssGSEA，xCell，MCP-counter，ESTIMATE等。

n?ssGSEA：?jiǎn)螛颖净蚣患治觯╯ingle sample gene set enrichment analysis, ssGSEA），是針對(duì)單個(gè)樣本無(wú)法做 GSEA 而設(shè)計(jì)的。最早是在 2009 年被提出（Systematic RNA interference reveals that oncogenic KRAS-driven cancers require TBK1），它可以使用?GSVA R 包來(lái)實(shí)現(xiàn)，目前 ssGSEA 常被用于評(píng)估腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度。?

n?MCP-counter (http://github.com/ebecht/MCPcounter ) 是由Becht團(tuán)隊(duì)于2016年開發(fā)的一個(gè)R包，該R包可以通過(guò)歸一化后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)量化異質(zhì)組織中8個(gè)免疫細(xì)胞和2個(gè)基質(zhì)細(xì)胞的絕對(duì)豐度。分?jǐn)?shù)的高低可以顯示其在免疫微環(huán)境中的浸潤(rùn)程度，細(xì)胞之間的豐度不可互相比較。

xCell（http://xcell.ucsf.edu/ ）是基于 ssGSEA 的方法，可根據(jù) 64 種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞類型的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞類型富集分析。Xcell 的輸入文件是來(lái)自人類混合樣本的基因表達(dá)矩陣（基因作為行，樣本作為列）。如果基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自微陣列，就不需要標(biāo)準(zhǔn)化。如果基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自一個(gè)測(cè)序平臺(tái)，數(shù)值必須被歸一化為基因長(zhǎng)度(例如，rpkm，tpm，fpkm)。Xcell 使用表達(dá)式級(jí)別排序，而不使用實(shí)際值，因此進(jìn)一步的規(guī)范化不會(huì)產(chǎn)生影響。該方法適用于基因表達(dá)譜和RNA-seq數(shù)據(jù)，但不適用于單細(xì)胞數(shù)據(jù)。

Estimate是一種使用基因表達(dá)特征來(lái)推斷腫瘤樣本中間質(zhì)和免疫細(xì)胞比例的方法，全稱為Estimation of STromal and Immune cells in MAlignant Tumor tissues using Expression data(使用表達(dá)數(shù)據(jù)估計(jì)惡性腫瘤中的間質(zhì)和免疫細(xì)胞)。ESTIMATE算法基于ssGSEA算法對(duì) stromal和immune 兩個(gè)基因集進(jìn)行打分，得到腫瘤樣本的基質(zhì)分?jǐn)?shù)(stromal score )和免疫分?jǐn)?shù)(immune score)，兩個(gè)分?jǐn)?shù)相加即得到estimate score，可用于估計(jì)腫瘤純度。

n?ImmuneCellAI（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/ImmuCellAI#!/）是一個(gè)免疫細(xì)胞豐度綜合分析網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，基于ssGSEA算法估算了包括RNA-Seq和微陣列數(shù)據(jù)在內(nèi)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中24個(gè)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度，同時(shí)可以預(yù)測(cè)患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的反應(yīng)。其中24個(gè)免疫細(xì)胞由18個(gè)T細(xì)胞亞型和6個(gè)其他免疫細(xì)胞組成：B細(xì)胞，NK細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和DC細(xì)胞。該網(wǎng)站分析功能較為突出，且圖片比較精美，對(duì)新手小白來(lái)說(shuō)真的是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

p?基于反褶積算法的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析方法

該方法將每個(gè)樣本看作是多種免疫細(xì)胞的混合，采用線性回歸擬合出每種免疫細(xì)胞的組分和表達(dá)量與最終混合后的關(guān)系，通過(guò)反卷積算法，提取每種免疫細(xì)胞的表達(dá)特征，其中最常用的免疫浸潤(rùn)分析方法是TIMER2、CIBERSORT和EPIC：

n?CIBERSORT（ https://cibersort.stanford.edu/? ）是目前引用次數(shù)最多的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)估計(jì)分析工具，2015年首次發(fā)表于Nature method。CIBERSORT利用線性支持向量回歸的原理對(duì)免疫細(xì)胞亞型的表達(dá)矩陣進(jìn)行去卷積，來(lái)估計(jì)免疫細(xì)胞的豐度。CIBERSORT 提供了 22 種常見(jiàn)的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù) LM22，包括不同的細(xì)胞類型和功能狀態(tài)的免疫細(xì)胞。其升級(jí)版CIBERSORTx不僅在于可以通過(guò)單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建專屬signature（各免疫細(xì)胞marker基因），還能夠推測(cè)各免疫細(xì)胞特征基因表達(dá)譜，進(jìn)一步將研究向機(jī)制方向伸展。

n?TIMER應(yīng)用反褶積算法從基因表達(dá)譜中推斷腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞（TIICs）的豐度。?TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org/ ) 是TIMER軟件的更新版本，是一個(gè)可交互式web工具，能夠?qū)δ[瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞進(jìn)行分析以及可視化。TIMER2.0版本主要包含Immune, Exploration, Estimate三大模塊，可以手動(dòng)輸入RNA-seq的基因TPM標(biāo)準(zhǔn)化值。TIMER2.0綜合TIMER, xCell, MCP-counter, CIBERSORT, EPIC和quanTIseq給出120個(gè)免疫微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞的得分。另外該軟件還基于以上六種方法對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有樣本進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析，并提供多個(gè)可視化線上工具。

n?EPIC（https://gfellerlab.shinyapps.io/EPIC_1-1 ）可根據(jù)表達(dá)數(shù)據(jù)分析出8種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例，包括B細(xì)胞、 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、CD4+T細(xì)胞、 CD8+T細(xì)胞、 內(nèi)皮細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞。EPIC的算法思路是使用約束最小二乘回歸將非負(fù)性約束條件明確納入反卷積問(wèn)題，并強(qiáng)加每個(gè)樣本中所有細(xì)胞分?jǐn)?shù)的總和不超過(guò)一。其使用簡(jiǎn)單，僅需提交RNA-Seq表達(dá)數(shù)據(jù)，設(shè)置參數(shù)，設(shè)置運(yùn)行任務(wù)名稱3步即可完成。

小云之聲

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