細(xì)胞的傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟

（1）取出存放在液氮中的細(xì)胞凍存管，握住管頂端放在37 ℃水浴中勻速震蕩溶解，直至有黃豆粒大小時(shí)快速移至超凈臺(tái)內(nèi)，防止二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）損傷細(xì)胞。

（2）在15 mL離心管加入5 mL 10% FBS新鮮培養(yǎng)液，將凍存管中液體轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，低速離心機(jī)內(nèi)1 000 rpm離心5 min，棄上清；

（3）隨后加入1 mL新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將重懸的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到已有5 mL新鮮培養(yǎng)液的10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，“∞”搖勻，觀察細(xì)胞均勻分散后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

注意：

（1）預(yù)熱培養(yǎng)用液：使用前把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶的離心管提前從4℃拿出防止室溫預(yù)熱；

（2）用75%酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手；

（3）正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且減少污染；

（4）點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小，保證操作環(huán)境周?chē)鸁o(wú)菌；

（5）嚴(yán)格的無(wú)菌操作；

（6）貼壁細(xì)胞消化適度：消化的時(shí)間受消化液的種類(lèi)、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化；

（7）傳代細(xì)胞所有的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作，每種細(xì)胞使用一套器材。避免交叉感染；

（8）傳代細(xì)胞瓶口，培養(yǎng)液的瓶口等每次打開(kāi)或者關(guān)閉都需要在酒精燈上消毒。

（9）一天觀察細(xì)胞次數(shù)最好在1-2次，頻繁觀察細(xì)胞容易破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，不利益細(xì)胞生長(zhǎng)；

（10）裝有已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶的離心管使用后注意在酒精燈上消毒，并且用封口膜封口。

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