一個實驗人的自救

大家好！本人在讀某985醫(yī)學院研二醫(yī)學生，實驗室學霸一枚！
最近，我們組舉辦了一場實驗室茶話會（也就是比慘大會），萬萬沒想到，我成功登頂實驗室的悲慘小王子。比慘談話實錄如下，（請大家不要對號入座）

1號學姐：

動物房的老鼠有多貴氣，大家都知道吧，夏天我們能熱死，但絕對不能熱到它們。
最慘的不是我沒養(yǎng)好它，而是由于管理不當，流浪貓咪吃了我養(yǎng)的第一批小鼠?。?！我甚至來不及為我的鼠兒子舉辦一場葬禮！

2號師兄：

剛養(yǎng)細胞那會，為了杜絕所有的可能污染源，我特地把培養(yǎng)箱里面金貴的振蕩器拿出來高壓滅菌。
當我從熱氣騰騰的滅菌鍋里拿出出爐的振蕩器，準備養(yǎng)細胞時，插上電源，噼里啪啦一陣響，剛開始干活就毀了一臺一萬多的儀器。

3號師妹：

記得剛來實驗室的那會，師兄讓我做質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。結(jié)果一個菌落都沒長出來，突然想起來，氨芐抗性的質(zhì)粒涂在卡那抗性的平板上了。

這不是最慘的，最慘的我把質(zhì)粒給隨手扔了！在師兄沒滅了我之前，我只好翻遍實驗室的所有垃圾桶，那酸爽，我至今難忘！

我：

最近，我在準備畢業(yè)論文，昨天，莫名其妙被導師揪去辦公室數(shù)落，說我做實驗不夠系統(tǒng)細致，很多都是自己想當然地做、不考慮清楚實驗的目的和意義。
總之，我被貶得一無是處！心情非常低落，覺得自己好失敗、發(fā)文章好難、畢業(yè)無望了！
被導師罵得灰頭土臉不說，最慘的是：我一直自認為是整個實驗室最有科研慧根的靚仔，在這場茶話會上，我發(fā)現(xiàn)，全實驗室就剩我一個人沒發(fā)過SCI了......家人們，我徹底破防了！

痛定思痛之下，我在實驗室獨自摸索了一個月。甚至，自學了原核表達和蛋白純化還有亂七八糟的各種實驗。
今天，為了重建我的實驗室“學霸”人設(shè)，我決定分享給大家一份生物分子類實驗室常用的實驗技術(shù)原理，好用到爆，保證讓你學會就能找回往日在實驗室丟失的臉面?。▌e贊了，要臉！）

1

GST?pull-down實驗

基本原理：將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡單易行，操作方便。注：GST即谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)

2

足印法（Footprinting）

足印法（Footprinting）是一種用來測定DNA-蛋白質(zhì)專一性結(jié)合的方法，用于檢測目的DNA序列與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可展示蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合。
其原理為：DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合后，DNA與蛋白的結(jié)合區(qū)域不能被DNase（脫氧核糖核酸酶）分解，在對目的DNA序列進行檢測時便出現(xiàn)了一段無DNA序列的空白區(qū)(即蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū))，從而了解與蛋白質(zhì)結(jié)合部位的核苷酸數(shù)目及其核苷酸序列。

3

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation）

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，利用該技術(shù)不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾以及轉(zhuǎn)錄因子與基因表達的關(guān)系。
染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是：在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別 反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。
染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化及鑒定。

4

基因芯片（DNA芯片）技術(shù)

基因芯片指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。
通俗地說，就是通過微加工技術(shù) ，將數(shù)以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段（基因探針），有規(guī)律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個二維DNA探針陣列，被稱為基因芯片?；蛐酒饕糜诨驒z測工作 。
基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。
當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。

5

高效液相色譜（HPLC）

高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。　高壓泵將貯液罐的流動相經(jīng)進樣器送入色譜柱中，然后從檢測器的出口流出，這時整個系統(tǒng)就被流動相充滿。當欲分離樣品從進樣器進入時，流經(jīng)進樣器的流動相將其帶入色譜柱中進行分離，分離后不同組分依先后順序進入檢測器，記錄儀將進入檢測器的信號記錄下來，得到液相色譜圖。

6

酵母雙雜交（Y2H）

7

噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時,外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。
噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望結(jié)合特性的目標噬菌體。

8

RNA提?。═rizol法）

Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。

9

RT-PCR

RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。
實驗步驟：1、RNA的提?。?/strong>2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；3、PCR擴增；4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定。

10

實時熒光定量PCR（Q-PCR）

利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析。閾值：是循環(huán)開始3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，設(shè)定在擴增曲線指數(shù)增長期。C(t)值：熒光信號（擴增產(chǎn)物）到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。

篇幅有限，需要更多實驗室常用實驗技術(shù)原理，在此給大家推薦一本《分子生物學實驗：實用操作技術(shù)與應(yīng)用案例》！

這是一本絕對能一掃你心中陰霾的科研好書，妥妥的讓基礎(chǔ)科研中的實驗小妖精瞬間化身為你的貼心小棉襖。經(jīng)本人親自試吃，哪里不會翻哪里，簡直不要太貼心實用！

全書共分為兩部分，上篇介紹了分子生物學的常用技術(shù)和方法, 基本原理、材料準備操作步驟和注意事項等內(nèi)容均囊括其中，實用性、通用性和可行性強，確保每位讀者在此書的指導下能獨立完成實驗。
下篇則用了很大的篇幅介紹這些實驗技術(shù)的應(yīng)用實例，對這些具體應(yīng)用實例的閱讀和了解，使得剛開始接觸和需要應(yīng)用分子生物技術(shù)的學生或研究人員能很容易地理解這些實驗技術(shù)的操作方法及應(yīng)用過程中各環(huán)節(jié)的要求，并使之盡快入門，學會應(yīng)用這些實驗技術(shù)設(shè)計自己的實驗方案。

內(nèi)頁插圖清晰明了，閱讀體驗感超棒！

我為大家總結(jié)了三大必讀理由！

必讀理由一：超多實驗技術(shù)應(yīng)用案例，小白可輕松理解實驗操作！
這本書用了很大的篇幅介紹了實驗技術(shù)的應(yīng)用實例，通過對這些具體應(yīng)用實例的閱讀和了解，可以讓剛開始接觸和需要應(yīng)用分子生物技術(shù)的科研小白，能很容易地理解這些實驗技術(shù)的操作方法及應(yīng)用過程中各環(huán)節(jié)的要求，并使其盡快入門，學會應(yīng)用這些實驗技術(shù)設(shè)計自己的實驗方案，也就約等于手把手教你實驗操作，對科研小白太友好了！

必讀理由二：內(nèi)容專為研究生量身定做，滿足進階所需！
作為研究生的必修課，掌握遺傳信息的傳遞和表達機制，學會運用基本的實驗技術(shù)對遺傳物質(zhì)進行實驗操作，對于培養(yǎng)和訓練大家的科研思維實在是大有益處。
在給研究生開課的過程中，作者就發(fā)現(xiàn)了大家學習分子生物學實驗技術(shù)的痛點。為了提高大家掌握和應(yīng)用分子生物學實驗操作技術(shù)的能力，提升實驗技術(shù)的應(yīng)用體驗，作者根據(jù)自己的研究經(jīng)驗及積累的實驗操作方法和技術(shù)技巧編寫了本書，相信你可以一學就會，順利上手！
必讀理由三：系統(tǒng)匯總了常用實驗操作技術(shù)，經(jīng)科研前輩試吃，很實用！
系統(tǒng)匯總了目前分子生物學中較為實用的一些實驗操作技術(shù)及應(yīng)用實例，對于小白而言，一本就夠的那種！
涉及的內(nèi)容包括PCR產(chǎn)物的亞克隆技術(shù)及應(yīng)用實例、原核表達載體的構(gòu)建與應(yīng)用實例、酵母細胞表達載體的構(gòu)建與應(yīng)用實例、差異表達基因的分離鑒定技術(shù)、轉(zhuǎn)基因株系表型分析技術(shù)、蛋白質(zhì)互作分析技術(shù)、轉(zhuǎn)錄因子的功能分析技術(shù)等。
重點是，這些技術(shù)經(jīng)過往屆研究生的體驗和反復(fù)應(yīng)用及驗證，被確認為可操作性與實用性較強的技術(shù)，請大家放心食用！

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