你了解蛋白質(zhì)組學(xué)揭示Nrf2在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激成骨分化中的潛在機(jī)制。

核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是抗氧化反應(yīng)和細(xì)胞防御的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對(duì)調(diào)節(jié)成骨分化有重要作用。之前的研究表明，Nrf2的激活參與了循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的人牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）成骨分化。然而，Nrf2在這一過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚。2022年01月06日，青蓮客戶發(fā)表了題為“Nrf2 Activation Is Involved in Cyclic Mechanical Stress-Stimulated Osteogenic Differentiation in Periodontal Ligament Stem Cells via PI3K/Akt Signaling and HO1-SOD2 Interaction”的研究論文。該研究通過(guò)基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析（青蓮百奧提供技術(shù)支持），探索Nrf2在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激成骨分化過(guò)程中在PDLSCs中的作用機(jī)制。

研究背景

牙齒正畸過(guò)程中的生物學(xué)基礎(chǔ)是牙槽骨重塑。牙槽骨重塑是一個(gè)連續(xù)、復(fù)雜、協(xié)調(diào)的生物學(xué)過(guò)程，包括正畸中成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收。人牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）中機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化是正畸中張力側(cè)牙槽骨重塑的重要組成部分。然而，正畸治療中的一些風(fēng)險(xiǎn)，如附著力喪失、牙槽骨丟失以及牙齦退化，對(duì)正畸醫(yī)生構(gòu)成了巨大的挑戰(zhàn)。為了避免正畸治療過(guò)程中可能出現(xiàn)的副作用，改善牙槽骨重塑，目前正畸醫(yī)生正在探索其分子機(jī)制，尋找潛在的治療分子靶點(diǎn)。該研究旨在通過(guò)TMT蛋白質(zhì)組學(xué)分析，探索Nrf2在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激成骨分化中的潛在機(jī)制。作者將Nrf2激活劑t-BHQ應(yīng)用于正畸大鼠，并通過(guò)免疫組織化學(xué)（IHC）染色檢測(cè)成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平，以確認(rèn)Nrf2可能是改善正畸牙槽骨重塑的一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)。

研究思路

研究結(jié)果

基于TMT的LC-MS/MS分析鑒定差異表達(dá)蛋白和生物信息學(xué)分析

與對(duì)照組相比，共觀察到162種差異表達(dá)蛋白，包括76種下調(diào)和86種上調(diào)蛋白（圖1A、B）。GO富集分析顯示，差異表達(dá)蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)、膜和細(xì)胞核中。并且這些差異表達(dá)蛋白參與了生物過(guò)程（BP）范疇內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫系統(tǒng)過(guò)程。參與了分子功能（MF）類別中的金屬離子結(jié)合、受體結(jié)合和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性（圖1C）。在差異表達(dá)蛋白的KEGG富集分析中（圖1D），PI3K/Akt信號(hào)通路引起了作者的注意，因?yàn)樗贜rf2的激活和易位中起著至關(guān)重要的作用。在隨后的研究中，選擇PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1. 基于TMT的LC-MS/MS分析鑒定差異表達(dá)蛋白和生物信息學(xué)分析

循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激成骨分化過(guò)程中PI3K/Akt信號(hào)通路參與PDLSCs中Nrf2的激活

為了證實(shí)循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激成骨分化期間，PI3K/Akt信號(hào)通路參與PDLSCs中的Nrf2激活，該研究應(yīng)用了PI3K克制劑LY294002。循環(huán)機(jī)械應(yīng)力增加了Akt（p-Akt）的磷酸化，而LY294002克制了p-Akt的水平（圖2A）。LY294002處理使得Nrf2的mRNA、細(xì)胞質(zhì)和核蛋白表達(dá)水平下調(diào)（圖2B、C）。接下來(lái)檢測(cè)了在PDLSCs中有和沒有LY294002的循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化能力。數(shù)據(jù)顯示LY294002克制成骨相關(guān)標(biāo)記物（COL1、RUNX2和OPN）的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平（圖2D、E）。并且也觀察到LY294002導(dǎo)致HO1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低。上述結(jié)果表明，PI3K/Akt通路與調(diào)節(jié)循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的PDLSCs成骨分化過(guò)程中Nrf2的表達(dá)有關(guān)。

圖2. 循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激PDLSCs成骨分化期間，PI3K/Akt信號(hào)通路參與Nrf2激活

HO1和SOD2之間的相互作用與循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化有關(guān)

之前的研究表明，循環(huán)機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)了Nrf2及其下游抗氧化劑HO1的表達(dá)。PPI分析發(fā)現(xiàn)，HO1和SOD2之間潛在的蛋白相互作用可能與循環(huán)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化有關(guān)。為了證實(shí)該結(jié)論，進(jìn)行了Co-IP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)了HO1和SOD2之間的相互作用與循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化有關(guān)。

圖3. 循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激下PDLSCs中HO1和SOD2的蛋白-蛋白相互作用

Nrf2激活對(duì)正畸大鼠成骨相關(guān)標(biāo)志物的影響

為了驗(yàn)證Nrf2可能是正畸治療的一個(gè)有前景的靶點(diǎn)，作者對(duì)正畸大鼠應(yīng)用了t-BHQ（Nrf2激活劑）。免疫組化染色檢測(cè)成骨相關(guān)標(biāo)志物在PDL中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)t-BHQ可促進(jìn)正畸大鼠張力側(cè)PDL中Nrf2及其下游抗氧化劑HO1的表達(dá)（圖4）。t-BHQ治療后，正畸大鼠成骨相關(guān)標(biāo)志物ALP和COL1的表達(dá)水平均上調(diào)（圖4）。這些結(jié)果表明，Nrf2可能是一個(gè)潛在的治療干預(yù)靶點(diǎn)，在正畸治療中對(duì)牙槽骨重塑具有的作用。

圖4. t-BHQ治療正畸大鼠張力側(cè)Nrf2、HO1、ALP、COL1表達(dá)增加

總結(jié)

綜上所述，Nrf2的激活通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路和HO1-SOD2的相互作用參與循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的PDLSCs成骨分化。Nrf2激活劑T-BHQ可增強(qiáng)正畸大鼠張力側(cè)成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平。Nrf2可能成為在正畸治療中改善牙槽骨重塑的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

Nrf2的激活通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路和HO1-SOD2相互作用參與牙周膜干細(xì)胞的循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激成骨分化

樣本選擇：人牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）

技術(shù)策略：TMT蛋白質(zhì)組學(xué)