qRT-PCR（實時熒光定量PCR）是RNAi的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，今天小優(yōu)就以一個siRNA沉默mRNA的案例來展示如何進(jìn)行計算吧~

RNAi實驗的步驟

本案例采用實時一步RT-PCR分析CDC2基因敲除情況。流程如下：

步驟1： siRNA轉(zhuǎn)染- HeLa S3細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶向人類CDC2基因的0.5 nM siRNA、陰性siRNA對照（與任何已知的哺乳動物基因沒有同源性的非沉默對照siRNA）。并添加未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。

步驟2： RNA純化——48小時孵育后，收集細(xì)胞，使用試劑盒純化RNA。

步驟3：使用以上RNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。使用一步法qRT-PCR試劑盒，（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和擴(kuò)增在同一試管中進(jìn)行）。進(jìn)行CDC2和GAPDH（一種管家內(nèi)源性參考基因）的基因特異性定量。

?qRT-PCR還需要注意以下內(nèi)容：

（1）無模板對照NTC：這是一個無模板RNA，可用ddH2O補(bǔ)足，包含擴(kuò)增反應(yīng)的所有成分。NTC可以檢測到qRT-PCR反應(yīng)組分中可能存在的任何污染。

（2）內(nèi)源性內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)化：內(nèi)源內(nèi)參基因是指表達(dá)水平在樣本之間不存在差異的基因。將目的基因與內(nèi)源性內(nèi)參基因進(jìn)行比較，可糾正RNA含量的變化和樣本處理中的其他差異。在本實驗中，使用管家基因GAPDH進(jìn)行歸一化。

（3）來自未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的模板：對未轉(zhuǎn)染對照的分析顯示，在沒有任何處理的情況下，基因表達(dá)水平。

（4）來自陰性siRNA對照的模板：將轉(zhuǎn)染陰性siRNA對照的細(xì)胞中的靶基因表達(dá)與轉(zhuǎn)染基因特異性siRNA后的基因表達(dá)進(jìn)行比較，計算基因敲除率。

未轉(zhuǎn)染對照組的基因表達(dá)水平應(yīng)與轉(zhuǎn)染陰性siRNA對照組觀察到的水平進(jìn)行比較。二者基因表達(dá)應(yīng)該是相似。這兩個樣本之間的任何基因表達(dá)差異都是由非特異性效應(yīng)引起的。

（5）每個樣本至少重復(fù)2次

重復(fù)實驗對于解釋樣本間的變化很重要，以確保數(shù)據(jù)是可靠和穩(wěn)健的。至少應(yīng)進(jìn)行2次重復(fù)實驗，重復(fù)之間的差異應(yīng)較低。為了確保變異是可接受的低水平，計算變異系數(shù)（%Cv=（標(biāo)準(zhǔn)偏差（重復(fù)）/平均CT（重復(fù)））x100）。這一點應(yīng)該始終低于3%。

步驟4：結(jié)果分析：獲取到可信的CT值，進(jìn)行計算。本實驗數(shù)據(jù)如下：

使用??CT方法計算siRNA沉默效率，計算公式如下：

靶基因表達(dá)=2-??CT

?CT (樣本) = CT 靶基因– CT內(nèi)參基因?

?CT (對照) = CT 靶基因?– CT內(nèi)參基因?

??CT = ?CT (樣本) – ?CT (對照)

本實驗數(shù)據(jù)帶入公式計算：?CT(樣本) = 26.22 – 15.49 = 10.73

?CT (對照) = 22.79 – 15.28 = 7.51

??CT= 10.73 – 7.51 = 3.22

樣本中靶基因表達(dá)= 2-3.22?= 0.107，CDC2 siRNA對樣本的沉默效率為：100%-10.7% = 89.3%。

一般來說，下調(diào)70%或以上被認(rèn)為是顯著高的。然而，根據(jù)細(xì)胞類型、靶基因和下游檢測的不同，較低的敲低水平可能也就足以用于RNAi研究。

其他的基因調(diào)控實驗，如miRNA mimic，cDNA等均可以使用同樣的方法進(jìn)行計算。

小優(yōu)推薦：

往期文獻(xiàn)閱讀推薦

#1.siRNA——你不知道的那些小奧秘

#2.為什么你的siRNA結(jié)果不被認(rèn)可

#3.如何快速啟動siRNA文庫篩選

#4.從培養(yǎng)細(xì)胞到qRT-PCR，QIAGEN一步反應(yīng)試劑盒助力快速基因檢測！

#5.qPCR這件“小”事兒

以上文章可直接進(jìn)公眾號“優(yōu)寧維分子生物學(xué)”進(jìn)行搜索查看