奶牛的乳腺分支形態(tài)發(fā)育是完成泌乳功能的基本條件。乳腺分支結(jié)構(gòu)可以通過提高乳腺腺泡組織的數(shù)量和分泌功能來提高奶牛乳產(chǎn)量。3D培養(yǎng)可以在體外誘導(dǎo)組織器官分支形態(tài)的發(fā)生，已經(jīng)是研究乳腺分支形態(tài)普遍使用的方法。

類器官(Organoids)是器官特異性細(xì)胞類型的3D細(xì)胞集合，這些細(xì)胞從干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞發(fā)育而來，并能以與體內(nèi)相似的方式經(jīng)細(xì)胞分序(cell sorting out) 和空間限制性的系別分化而實(shí)現(xiàn)自我組建。

圖1 奶牛乳腺類器官明場圖展示

三、培養(yǎng)方法

1、原代培養(yǎng)

1）取材后的奶牛乳腺組織須在 2-8℃含有組織保存液 E的取樣瓶中，快速轉(zhuǎn)運(yùn)至潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織處理和干細(xì)胞分離，拍照并登記信息。
2）準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿，加入 4℃預(yù)冷的奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B備用。
3）取樣瓶消毒，將組織放入培養(yǎng)皿中，利用奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B清洗三次后，利用眼科剪或手術(shù)刀將腫瘤組織剪切成體積約為1-3mm3的組織塊。
4）組織用奶牛乳腺原代組織消化液 C消化，37℃震蕩消化10-20min，（消化過程中隨時觀察消化情況）。
5）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個細(xì)胞或 70um 以下的細(xì)胞簇后，加入三倍體積奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B終止消化。
6）使用100um孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，將濾液收集后，于300g富集離心5min后移去上清，添加奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B重新重懸離心。
7）基質(zhì)膠計算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠重懸鋪板。
8）24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點(diǎn)膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板（4℃下操作）。
9）將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加奶牛乳腺類器官培養(yǎng)基 A（恢復(fù)室溫）進(jìn)行培養(yǎng)。

2、 類器官傳代培養(yǎng)

1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液 B放置2min；
2）移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min（每6-8孔為一組）；
3）a. 類器官數(shù)量不足或體積較小時： 離心5min棄去上清，添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進(jìn)行第4步；
b. 類器官數(shù)量較多或體積較大時：離心5min棄去上清，添加適量類器官傳代消化液 D消化2-3min，添加奶牛乳腺類器官緩沖液 B終止消化，離心5min棄去混合液，添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進(jìn)行第4步；
4）類器官收集后，添加基質(zhì)膠重懸，每孔25ul基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min添加500ul奶牛乳腺類器官培養(yǎng)基A。

3、類器官凍存

1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液 B放置2min；
2）移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min（每6-8孔為一組）；
3）離心5min棄去上清，添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B再次重懸，300g離心5min棄去液體；
4）添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸，以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例：密度為2個孔凍存1管，每管體積1.4ml；
5）做好標(biāo)記信息，進(jìn)行程序降溫后，移入液氮長期保存。

4、 類器官復(fù)蘇

1）取10ml奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B于15ml離心管中；
2）從液氮罐中取出凍存的類器官細(xì)胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解；
3）水浴融解過程中，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2min內(nèi)完全融解；
4）將溶解后的類器官細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 離心管，使用移液管輕輕吹打6-8次，300g 離心 5min，然后除去上清液并收集類器官細(xì)胞沉淀。添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B重懸移入1.5ml離心管300g離心5min；
5）基質(zhì)膠重懸，每孔25ul基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加500ul奶牛乳腺類器官培養(yǎng)基 A。

圖2 奶牛類器官試劑盒組分展示