背景介紹

蛋白降解靶向嵌合體（PROTAC）技術(shù)是目前小分子藥物研發(fā)領(lǐng)域最火熱的技術(shù)之一。它顛覆了傳統(tǒng)藥物化學(xué)中“占位驅(qū)動(dòng) (occupancy driven)”的開發(fā)理念，借助內(nèi)源性的泛素蛋白酶體系統(tǒng)有效地特異性降解致病蛋白，尤其是“不可成藥（undruggable）”靶點(diǎn)。如此優(yōu)秀的技術(shù)，不但讓國內(nèi)外眾多制藥巨頭和Biotech公司趨之若鶩，更為科學(xué)家們打開了新世界的大門。中國科學(xué)院司龍龍課題組剛剛在Nature子刊發(fā)表了基于PROTAC技術(shù)的流感疫苗[1]doi: 10.1038/s41587-022-01381-4，沈陽藥科大學(xué)陳麗霞和李華團(tuán)隊(duì)又創(chuàng)造性地將這項(xiàng)技術(shù)引入到了中藥研究領(lǐng)域，在Acta Pharmaceutica Sinica B（APSB）發(fā)表了題為“PROTAC Technology as a Novel Tool to Identify the Target of Lathyrane Diterpenoids”的研究論文 [2] doi: 10.1016/j.apsb.2022.07.007。

中藥活性成分和其作用靶點(diǎn)的鑒定均在中藥研發(fā)領(lǐng)域具有重要的科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。尤其是靶點(diǎn)鑒定，它是理解中藥機(jī)制和下游藥物開發(fā)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。但由于中藥“多靶點(diǎn)、多成分”的作用模式，以及與靶點(diǎn)蛋白瞬時(shí)、弱親和力的相互作用，導(dǎo)致中藥的靶點(diǎn)鑒定存在巨大挑戰(zhàn)，亟需研究的思路創(chuàng)新和技術(shù)創(chuàng)新。

PROTAC技術(shù)中的蛋白降解劑是一種含有兩個(gè)活性端的小分子化合物，一個(gè)活性端可與靶蛋白結(jié)合而另一個(gè)活性端結(jié)合E3連接酶；兩個(gè)活性端通過linker相連接。鑒于PROTAC分子往往無需很強(qiáng)的親和力即可有效地特異性降解靶蛋白，沈陽藥科大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)大膽猜想該技術(shù)可用于鑒定中藥成分及天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)。研究人員將PROTAC技術(shù)與定量蛋白組學(xué)、微量熱泳動(dòng)（MST）分子互作檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，從被降解的差異蛋白中找到中藥靶點(diǎn)，并通過下游的一系列分子、生物化學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到了功能驗(yàn)證。該流程被研究團(tuán)隊(duì)稱為“靶向降解組學(xué)”，可以為中藥成分的靶點(diǎn)鑒定提供新的解決方案。

實(shí)驗(yàn)解讀

沈陽藥科大學(xué)陳麗霞和李華團(tuán)隊(duì)在前期研究中從中藥千金子中獲得了一系列千金烷二萜類化合物，其中ZCY-001化合物具有最強(qiáng)的抗炎活性，并且具有低毒性。

研究人員將該化合物的核心骨架Lathyrol（即千金子二萜醇）與沙利度胺 (E3連接酶CRBN配體) 通過PEG linker相連，得到了PROTAC分子ZCY-PROTAC。使用該P(yáng)ROTAC分子對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后提取蛋白，并使用TMT串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記定量蛋白組學(xué)分析（圖1 A）。比較蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MAFF蛋白在ZCY-PROTAC處理后發(fā)生了最為顯著的降解。Western Blot結(jié)果也顯示, MAFF蛋白的降解水平與ZCY-PROTAC的劑量和作用時(shí)間是正相關(guān)的（圖1 B）。

這些結(jié)果表明，該蛋白可能是Lathyrol等千金烷二萜類化合物的最主要靶點(diǎn)。

為了驗(yàn)證比較蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)蛋白，研究人員采用微量熱泳動(dòng)(MST）技術(shù)直接檢測(cè)Lathyrol及其衍生物ZCY020與MAFF蛋白的結(jié)合能力。

如下圖所示，Lathyrol與MAFF的親和力為20.90 μM，ZCY020對(duì)MAFF的親和力也在同一水平。以上親和力檢測(cè)結(jié)果也通過表面等離子共振（SPR）、細(xì)胞熱遷移分析（CETSA）以及DARTS等實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證。這些結(jié)果證實(shí)了MAFF蛋白是中藥千金子成分的直接作用靶點(diǎn)。

研究人員進(jìn)一步采用生化和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)深入研究闡明了千金烷二萜ZCY020以MAFF為靶點(diǎn)蛋白, Nrf2/HO-1信號(hào)通路為作用途徑發(fā)揮抗炎作用。ZCY02可以促進(jìn)MAFF-Nrf2異源二聚體的形成而抑制MAFF同源二聚體，進(jìn)而調(diào)節(jié)HO-1的下游表達(dá)，從而在體內(nèi)外發(fā)揮抗氧化和抗炎活性。

本研究創(chuàng)造性地將PROTAC技術(shù)應(yīng)用在了中藥成分靶點(diǎn)的鑒定上，首先以中藥活性成分為基礎(chǔ)合成出PROTAC分子探針，再通過蛋白的特異性降解來發(fā)現(xiàn)中藥活性成分的靶點(diǎn)蛋白。以MST為代表的的分子互作檢測(cè)技術(shù)在靶點(diǎn)驗(yàn)證中發(fā)揮了重要作用，可直接定量分析中藥活性成分與靶點(diǎn)蛋白的親和力。作者將這一系列技術(shù)手段整合為一套可行的中藥成分靶點(diǎn)鑒定新方法，可以有力地補(bǔ)充甚至替代現(xiàn)有技術(shù)。

關(guān)于Monolith新一代分子互作檢測(cè)儀

德國NanoTemper公司自2010年推出第一款基于微量熱泳動(dòng)技術(shù)的Monolith分子互作儀。隨著工業(yè)用戶的增多且對(duì)高通量檢測(cè)的需求越來越迫切，NanoTemper公司于2014年推出了自動(dòng)化的檢測(cè)儀器Monolith NT.Automated?；谟脩舻姆答?，在2020年對(duì)該產(chǎn)品線進(jìn)行了全面升級(jí)，推出了全新的Monolith系列儀器。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

• 僅需微量樣品，即可直接在溶液中測(cè)定分子間結(jié)合。

• 無需固定，不受檢測(cè)樣品種類的限制。

• 檢測(cè)速度快、測(cè)量范圍廣 (Kd?: 從pM到mM)。

• 儀器操作簡(jiǎn)單，無需繁瑣的清洗維護(hù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Si L, Shen Q, Li J, et al. Generation of a live attenuated influenza A vaccine by proteolysis targeting.?Nat Biotechnol. 2022 Jul 4.?

[2] Wu Y, Yang Y, Wang W, et al. PROTAC Technology as a Novel Tool to Identify the Target of Lathyrane Diterpenoids.?Acta Pharmaceutica Sinica B. 2022 Jul 16.