2023年8月23日，南京大學(xué)呂瑛、陳迪俊、鄒曉平及閆超共同通訊在Nature Communications雜志（IF=16.6）發(fā)表題為“Single cell transcriptomic analyses implicate an immunosuppressive tumor microenvironment in pancreatic cancer liver metastasis”的研究論文，本研究通過scRNA-seq技術(shù)探索胰腺導(dǎo)管腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，為開發(fā)轉(zhuǎn)移性個體化治療提供思路。

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子：16.6

文章技術(shù)：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是一種高度轉(zhuǎn)移性疾病，所有靶向和免疫治療都難以治療。PDAC通常在晚期才被發(fā)現(xiàn)，對現(xiàn)有的治療方法有很強(qiáng)的抵抗力，部分原因是在最初診斷時遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率極高(>80%)，肝是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要部位，然而，我們對PDAC患者肝轉(zhuǎn)移的治療方法仍然明顯缺乏。因此，迫切需要闡明驅(qū)動PDAC肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，這可能為開發(fā)更有效的治療方法鋪平道路，并最終提高晚期患者的生存率。

作者全面分析了PDAC原發(fā)腫瘤和配對的肝轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤免疫微環(huán)境TME景觀。不僅揭示了腫瘤細(xì)胞在原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位之間不同的轉(zhuǎn)錄組特性，而且還鑒定了基質(zhì)和免疫細(xì)胞的特定亞型可能有助于轉(zhuǎn)移性病變中免疫抑制微環(huán)境形成。這些結(jié)果為了解PDAC肝轉(zhuǎn)移和為PDAC轉(zhuǎn)移患者開發(fā)轉(zhuǎn)移性個體化治療提供了有用的機(jī)制信息。

Result1 PDAC原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移性病變的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜和細(xì)胞分型

為了全面了解TME在PDAC轉(zhuǎn)移中的作用，作者對4例PDAC患者（P1-P4）采集的8個新鮮組織進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序，包括三個手術(shù)切除的原發(fā)性胰腺腫瘤(PT)及其相應(yīng)的配對肝轉(zhuǎn)移瘤(HM)，以及來自三個患者之一的1個正常胰腺組織(NT -PT-HM和2個PT-HM對，共7個樣本)。第4例患者通過超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的細(xì)針穿刺(EUS-FNA)獲得的肝轉(zhuǎn)移活檢。鑒定為12種主要細(xì)胞類型，且在正常和癌變胰腺組織中發(fā)現(xiàn)了兩種獨(dú)特的細(xì)胞類型，即腺泡細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞(統(tǒng)稱為分泌細(xì)胞)，而在肝轉(zhuǎn)移組織中卻沒有發(fā)現(xiàn)，證明數(shù)據(jù)分析的細(xì)胞類型注釋無偏好性[圖1]。

作者注意到導(dǎo)管細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的比例在每個患者中都有很大的不同，這與之前在其他癌癥類型中的發(fā)現(xiàn)一致。有趣的是，三種細(xì)胞類型：導(dǎo)管細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和髓系細(xì)胞在患者或組織類型中表現(xiàn)出高度異質(zhì)性，同時也是差異表達(dá)基因(DEGs)最多的細(xì)胞類型，表明這些細(xì)胞類型在不同環(huán)境中具有高度動態(tài)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。此外，作者使用CIBERSORTx的反卷積分析，在更大隊列配對的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性PDAC樣本的大量RNA-seq數(shù)據(jù)中驗證了上述發(fā)現(xiàn)。作者觀察到樣本中基質(zhì)細(xì)胞和髓系細(xì)胞的相對豐度與發(fā)表的RNA-seq數(shù)據(jù)的相似。

圖1 原發(fā)性和配對轉(zhuǎn)移PDAC組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

Result2 導(dǎo)管細(xì)胞表現(xiàn)出高度異質(zhì)性的CNV模式

作者根據(jù)每個亞群高表達(dá)的基因?qū)?dǎo)管細(xì)胞進(jìn)一步分成6個亞群， MKI67+細(xì)胞幾乎只出現(xiàn)在腫瘤組織中，提示腫瘤細(xì)胞具有高增值的能力。相反，RPS3+細(xì)胞是出現(xiàn)在NT組織的主要導(dǎo)管細(xì)胞群，表示這些細(xì)胞是惡性程度低的（稱為“良性導(dǎo)管細(xì)胞”）。

為了進(jìn)一步確定導(dǎo)管細(xì)胞亞群的惡性程度，inferCNV分析顯示，在NT樣本中幾乎沒有觀察到CNV事件。與NT和PT組織相比，來源于HM組織的膽管細(xì)胞展現(xiàn)出顯著的高CNV水平，預(yù)示著高惡性表型。此外，基因集變異分析(GSVA)發(fā)現(xiàn)，CNV高水平組主要富集于TGF-β信號通路、NOTCH信號通路、MYC靶點(diǎn)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路。

為了探討在本研究中發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)管細(xì)胞亞型infer的臨床意義，作者利用CIBERSORTx估計了來自TCGA PDAC隊列患者樣本中每個導(dǎo)管細(xì)胞亞群的百分比。有趣的是，CEACAM6+細(xì)胞和CEACAM5+導(dǎo)管細(xì)胞的豐度均與較差的總生存率(OS)顯著相關(guān)。相反，MALAT1+細(xì)胞的豐度與較好的OS相關(guān)，這與該細(xì)胞高表達(dá)基因富集的“白細(xì)胞介導(dǎo)免疫” 免疫系統(tǒng)過程的正向調(diào)節(jié)”和“淋巴細(xì)胞活化的正向調(diào)節(jié)”相關(guān)的觀察結(jié)果一致[圖2]。

圖2 導(dǎo)管細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征和CNV異質(zhì)性

Result3 從原發(fā)性到轉(zhuǎn)移性PDAC，發(fā)育軌跡決定了不同的導(dǎo)管細(xì)胞狀態(tài)和進(jìn)化動力學(xué)

如上所述，MKI67+ 導(dǎo)管細(xì)胞可能充當(dāng)一種類型再生/增殖性腫瘤細(xì)胞，因為它們只存在于腫瘤而非正常組織中，而 CEACAM5+ 導(dǎo)管細(xì)胞可能代表一類具有高水平 CNV 的惡性轉(zhuǎn)移細(xì)胞，它們在 HM 組織中占主導(dǎo)地位。作者使用RNA velocity和Monocle2進(jìn)行了無監(jiān)督的細(xì)胞軌跡分析。兩種分析結(jié)果均顯示導(dǎo)管細(xì)胞起源于干細(xì)胞樣/增殖細(xì)胞，基于Monocle2的偽時間軌跡分析定義了5種細(xì)胞state(S1-S5)。然而，CEACAM5/6+ 的導(dǎo)管細(xì)胞是S5 state主要的cluster，并且僅在腫瘤組織的最后階段出現(xiàn)，顯示出其高度惡性的性質(zhì)，稱為“胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞”。

由于S5代表與胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的終點(diǎn)導(dǎo)管細(xì)胞狀態(tài)，作者將S5中來源于HM組織的導(dǎo)管細(xì)胞中高表達(dá)的基因，以及CNV水平細(xì)胞中高表達(dá)的標(biāo)記基因進(jìn)行維恩分析，顯示了11個共同的差異表達(dá)基因。這組基因可能是惡性轉(zhuǎn)移細(xì)胞的潛在分子標(biāo)記。值得注意的是，LITAF和SPRR1B在轉(zhuǎn)移性中高表達(dá)和在TCGA數(shù)據(jù)集中這兩個基因的高表達(dá)與預(yù)后不良顯著相關(guān)。免疫組化的結(jié)果顯示，相比于PT組織，LITAF蛋白在HM組織中上調(diào)。此外，IHC分析也證實(shí)了這一點(diǎn)， 提示到LITAF的表達(dá)與PDAC的轉(zhuǎn)移進(jìn)展有關(guān)。

圖3 擬時序分析顯示不同導(dǎo)管細(xì)胞的分化state

Result4 癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞亞型及其對轉(zhuǎn)移性PDAC微環(huán)境的貢獻(xiàn)

接下來，本研究分析了腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)所有的成纖維細(xì)胞群都高表達(dá)癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)標(biāo)記物。根據(jù)已知marker將成纖維分成3類主要的細(xì)胞亞群：cluster0-5為肌成纖維細(xì)胞(myCAFs)、cluster6為抗原呈遞細(xì)胞成纖維(apCAFs)、cluster7為炎癥相關(guān)成纖維(iCAFs)。本研究中apCAF和iCAFs大部份富集于NT組織。myCAF cluster中，（RGS5+ myCAF）主要存在于HM組織中，所有myCAF cluster中，都高表達(dá)與侵襲性胰腺癌相關(guān)的FN1，。通過多色免疫熒光染色驗證了αSMA和RGS5在PT和HM組織中共表達(dá)，且在HM組織中，RGS5+ myCAFs在導(dǎo)管細(xì)胞周圍的富集明顯高于在PT組織中，這凸顯了RGS5+ myCAFs在PDAC轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的潛在生物學(xué)意義。

為了探討這些不同的CAF亞群在胰腺癌轉(zhuǎn)移中的發(fā)展機(jī)制和潛在作用，擬時序和RNA速率顯示CFD+ iCAF是最早和最原始的細(xì)胞群，RGS5+ myCAF是最成熟的細(xì)胞群。揭示了五種不同的細(xì)胞state(S1-S5)和兩條主要的軌跡路線，這兩個state通過來自PT腫瘤的CAFs向來自HM腫瘤的myCAFs富集的細(xì)胞state分化，提示兩種分化軌跡都與胰腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。綜上所述，該研究揭示了PDAC 轉(zhuǎn)移進(jìn)展過程中特定 myCAF 亞群的富集。

圖4 原發(fā)和轉(zhuǎn)移性PDAC組織腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜分析

Result5 脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞(LAMs)在PDAC肝轉(zhuǎn)移中扮演重要的角色

因為HM組織中巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞的比例明顯高于PT組織，作者研究了PDAC肝轉(zhuǎn)移中髓系來源細(xì)胞的組成和基因表達(dá)。脂肪相關(guān)巨噬細(xì)胞LAM1和LAM2亞群都高表達(dá)與促進(jìn)癌癥進(jìn)展的TAMs分泌的SPP1基因；然后LAM3和LAM4高表達(dá)免疫抑制和腫瘤促進(jìn)相關(guān)的CCL18，其中，LAM3細(xì)胞主要存在于HM組織中。在HM組織中LAM3細(xì)胞表達(dá)的脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和免疫相關(guān)基因都高于PT和NT組織，LAM3細(xì)胞高表達(dá)免疫抑制分子，且與不良預(yù)后顯著相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明CCL18+ LAM3細(xì)胞在PDAC轉(zhuǎn)移微環(huán)境中具有重要作用。

為了解LAMs在PDAC轉(zhuǎn)移中的代謝譜，利用scMetabolism分析發(fā)現(xiàn)HM組織中的LAM代謝評分明顯高于PT和NT組織。特別是在HM組織中富集的LAM3細(xì)胞在所有LAM中表現(xiàn)出最高的代謝活性，這表明它們在轉(zhuǎn)移部位非常重要和充滿活力的。

據(jù)報道，中性粒細(xì)胞是轉(zhuǎn)移性腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，且在HM組織中顯著富集。作者鑒定了兩個中性粒細(xì)胞群體。其中，與PT和NT組織相比，S100A8+中性粒細(xì)胞標(biāo)記物在HM組織中的表達(dá)顯著升高，而S100A8幾乎只在HM組織中表達(dá)。通過免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了HM組織中S100A8+中性粒細(xì)胞的浸潤增加，表明S100A8+中性粒細(xì)胞的浸潤與PDAC的轉(zhuǎn)移進(jìn)展密切相關(guān)。?

圖5 髓系細(xì)胞在原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移組織腫瘤微環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄圖譜

Result6 淋巴細(xì)胞重編程在PDAC中的轉(zhuǎn)移性微環(huán)境

接下來，作者將淋巴細(xì)胞分成7類CD4T，4類CD8+ T和1類NK細(xì)胞。值得注意的是，NK細(xì)胞中GNLY、NKG7、CCL3和KLRD1在腫瘤組織中高表達(dá)，特別是在HM組織中。此外，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性基因表達(dá)顯著上調(diào)。免疫熒光染色也顯示，HM組織中GNLY+ NK細(xì)胞較PT組織增加，提示NK細(xì)胞在PDAC的轉(zhuǎn)移性生長中起著重要作用。類似的，F(xiàn)OXP3+ Treg細(xì)胞在PT和HM腫瘤組織中大量富集，且免疫檢查點(diǎn)基因在HM中顯著高表達(dá)，表明FOXP3+ Treg細(xì)胞可能在轉(zhuǎn)移性PDAC中發(fā)揮作用。CXCL13+ TFH細(xì)胞在GZMA、GZMB、TNFSF10、GNLY等細(xì)胞毒性基因高表達(dá)的腫瘤中也有富集。而HM組織中TFH細(xì)胞的比例則低于PT組織。值得注意的是，CXCL13+ TFH細(xì)胞高表達(dá)可增強(qiáng)T細(xì)胞毒性的免疫檢查點(diǎn)相關(guān)蛋白PDCD1、LAG3和HAVCR2?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，多個免疫檢查點(diǎn)基因在Treg和TFH細(xì)胞群體中表達(dá)。特別是，一些檢查點(diǎn)基因在轉(zhuǎn)移微環(huán)境中（HM組織）的Treg細(xì)胞中顯著上調(diào)。

圖6 原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移組織的腫瘤微環(huán)境中淋巴樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄景觀

Result7 淋巴細(xì)胞重編程在PDAC中的轉(zhuǎn)移性微環(huán)境

最后，為了解讀PDAC轉(zhuǎn)移過程中腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞之間的互做，CellPhoneDB顯示，不同細(xì)胞類型在HM組織中的相互作用遠(yuǎn)低于PT組織。且HM組織中免疫細(xì)胞（特別是NK/T細(xì)胞）與其他類型的細(xì)胞之間的相互作用顯著減少。作者還發(fā)現(xiàn)在HM組織中，NK/T細(xì)胞幾乎沒有與腫瘤導(dǎo)管細(xì)胞發(fā)生相互作用；與PT組織相比，HM組織中髓系細(xì)胞與導(dǎo)管細(xì)胞之間的相互作用也顯著減少，提示轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞與周邊環(huán)境接觸的較少，這可能是PDAC細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位定植的重要機(jī)制。

圖7 原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性PDAC組織腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞-細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)

本研究為配對原發(fā)和轉(zhuǎn)移PDAC腫瘤組織的腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞組分的轉(zhuǎn)錄譜和功能特征提供了深入的見解。

參考文獻(xiàn)

Zhang S, Fang W, Zhou S et al. Single cell transcriptomic analyses implicate an immunosuppressive tumor microenvironment in pancreatic cancer liver metastasis. Nat Commun. 2023 Aug 23;14(1):5123. doi: 10.1038/s41467-023-40727-7.?