一.文章基本信息

文章來(lái)源：鄭艷玲, 姜八一, 張涌. DMEM與Ham's F-10培養(yǎng)基對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化影響比較研究[J]. 中國(guó)畜禽種業(yè), 2022, 18(5): 26-29.
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二.文章全文

摘 要：?本研究旨在比較DMEM 與Ham's F-10 兩種培養(yǎng)基對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中增殖與分化的影響。采用膠原酶和胰酶聯(lián)用的方法分離骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后平均分為兩組，分別采用DMEM 和Ham's F-10 培養(yǎng)基對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用RT-PCR 和免疫熒光方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并觀察比較兩種培養(yǎng)基對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的影響。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)采用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)7d 后的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞不經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化能自行發(fā)生分化成肌管，而用Ham's F-10 培養(yǎng)基培養(yǎng)7d 后的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞90%以上處于增殖狀態(tài)，僅有少量細(xì)胞發(fā)生分化融合成肌管。本研究結(jié)果表明，Ham's F-10 比DMEM 更有利于牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，抑制其分化。

關(guān)鍵詞：?牛；骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞；DMEM；Ham's F-10；增值；分化

?

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(skeletal satellite cells) 是一類位于骨骼肌肌膜(sacrolenuna) 與基底膜(haaslelmin) 之間的成體干細(xì)胞?[1]，因其位置與排列類似肌細(xì)胞的衛(wèi)星，因此被稱為衛(wèi)星細(xì)胞。1961 年，Muaor 首次從青蛙骨骼肌纖維中發(fā)現(xiàn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，這些細(xì)胞在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育和再生過(guò)程中發(fā)揮著非常重要作用?[2]。一般情況下，這些細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，而當(dāng)肌細(xì)胞受到損傷刺激時(shí)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞即被激活、增殖并與原有的骨骼肌細(xì)胞相互融合，形成新的肌纖維細(xì)胞?[3]，1974 年，Bischoff從大鼠骨骼肌中分離出骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行了體外培養(yǎng)，隨后很多種動(dòng)物的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞被成功分離及培養(yǎng)?[4-10]。

體外培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞可應(yīng)用于組織工程、基因治療及基因功能研究等多個(gè)方面，因此，有必要建立理想的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)與純化的方法，為利用骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞研究基因功能打下基礎(chǔ)。以目前的實(shí)驗(yàn)方法所獲得的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中不可避免會(huì)混有成纖維細(xì)胞，因此，獲得高純度的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞一直是研究者不斷追求的目標(biāo)。本研究采用混合酶消化法分離得到了大量?jī)?yōu)質(zhì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，采用DMEM和Ham’?s F-10 兩種培養(yǎng)基對(duì)分離的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)比較研究，為獲得高純度牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，并使其處于增殖狀態(tài)培養(yǎng)基的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

牛胎兒取自西安屠宰場(chǎng)。置于4℃PBS 保存液中，在12 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。保存液為PBS+200 IU/ml 青霉素+200 IU/ml鏈霉素。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

從西安屠宰場(chǎng)取60d 左右的牛胎兒，取其后肢肌肉組織，用含青鏈霉素的PBS 溶液將肌肉塊沖洗干凈，在無(wú)菌條件下剔除血管、結(jié)締組織，將肌肉組織剪成盡量小的組織塊，將剪碎的組織放入5ml?離心管中，加入1 倍體積的混合酶消化液（dispase II 2.4U/ml，collagenase 1%，CaCl2 2.5mmol/L)，37℃消化45min，其每間隔15min 用吸管吹打5min，重復(fù)3 次，然后加入兩倍體積含20% FBS 的培養(yǎng)液中中止消化，反復(fù)吹打后濾過(guò)200 目的篩網(wǎng)，收集濾液，500g/min 離心7min，棄上清液，分兩組分別用含15%胎牛血清的Ham’?s F-10 及DMEM 生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

2.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的純化

將裝有重懸骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)皿置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h，進(jìn)行第一次貼壁，記為P1。0.5h 后，吸取培養(yǎng)皿上清液置入新的培養(yǎng)皿中，混勻，進(jìn)行第2 次貼壁，記為P2。24h 后取P2 上清液，1000r/min 離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸，移入新的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行第3 次貼壁，記為P3。棄去P1、P2，將培養(yǎng)有P3 細(xì)胞的培養(yǎng)皿中的細(xì)胞每隔2d 更換新的生長(zhǎng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及增殖狀況。

2.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的確定

用四甲基偶氮唑鹽實(shí)驗(yàn)（MTT）比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.4 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞RT-PCR 擴(kuò)增鑒定

采用Trizol 試劑(Invitrogen) 提取貼壁生長(zhǎng)48h 的衛(wèi)星細(xì)胞總RNA，按照PrimeScript??RT reagent Kit (Perfect Real Time) 說(shuō)明書合成cDNA 第一鏈，以cDNA 為模板對(duì)牛生肌調(diào)節(jié)基因MyoD、Myf5、Myogenin、MRF4 及β-actin 基因進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。引物序列如表1。

表1 RT-PCR 引物序列

2.5 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的免疫熒光鑒定

取原代分離后傳至第2?代的細(xì)胞，在DMEM培養(yǎng)基及Ham's F-10 培養(yǎng)基中均培養(yǎng)24h 及7d 后，采用免疫熒光方法鑒定骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的肌源性標(biāo)志中間絲蛋白desmin 的表達(dá)，同時(shí)用hochest 對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以本實(shí)驗(yàn)室保存的成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

3 結(jié)果

3.1 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的獲得與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

3.1.1 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

經(jīng)酶消化后獲得的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為球形，將其接種在鋪有多聚賴氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行差速貼壁純化后獲得的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在接種24h 后細(xì)胞開始貼壁，培養(yǎng)2d 后細(xì)胞貼壁完全并開始增殖。貼壁后絕大多數(shù)細(xì)胞為紡錘形或梭形，細(xì)胞體積比成纖維細(xì)胞要小，但核質(zhì)比比較大，有兩極性，胞核折光性較強(qiáng)。少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)多角形的形狀，有細(xì)胞突起，肌細(xì)胞之間會(huì)相互聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀（如圖1 所示）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸呈現(xiàn)有規(guī)律性的平行方向排列生長(zhǎng)狀態(tài)。

圖1 貼壁生長(zhǎng)2d 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(×200）

3.1.2 采用MTT 法測(cè)定骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接種24h 后細(xì)胞開始增殖，2d 后增殖旺盛，3d?后細(xì)胞增殖速度達(dá)到高峰，4d 后細(xì)胞逐漸停止增殖，其中Ham's F-10 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞比DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞增殖活力要高一些，結(jié)果如圖2。

圖2 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞RT-PCR?擴(kuò)增鑒定結(jié)果

分離的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d，細(xì)胞處于增殖旺盛期，因此，進(jìn)行RT-PCR 實(shí)驗(yàn)時(shí)能擴(kuò)增出增殖期骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的標(biāo)記基因MyoD 和Myf5，而分化期標(biāo)記基因myogenin 和MRF4 也有表達(dá)，但表達(dá)量很少，說(shuō)明分離的細(xì)胞為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，結(jié)果如圖3。

圖3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記基因RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果
M：50 bp DNA Ladder；1：MyoD；2：Myf5；3：myogenin；4：MRF4

3.3 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組成纖維細(xì)胞desmin 免疫熒光檢測(cè)不發(fā)光，為陰性，如圖4A；骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞desmin 免疫熒光檢測(cè)發(fā)紅色熒光，為陽(yáng)性，如圖4B；分離的細(xì)胞在Ham's F-10 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d 后，細(xì)胞仍然處于增殖狀態(tài)，培養(yǎng)4d 后細(xì)胞增殖變慢，培養(yǎng)7d 后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的純度達(dá)99%以上，接近100%，少量骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化融合為肌管，細(xì)胞desmin 免疫熒光檢測(cè)均發(fā)紅色熒光，基本沒(méi)有成纖維細(xì)胞存在，如圖4C，說(shuō)明，Ham's F-10 培養(yǎng)基對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用；分離的細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d后，細(xì)胞達(dá)到80%以上的匯合度，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞進(jìn)入分化階段，細(xì)胞相互靠攏、融合，培養(yǎng)7d 后細(xì)胞完全融合成較粗的肌管，desmin 免疫熒光檢測(cè)發(fā)紅色熒光，肌管之間混雜有很多不發(fā)紅色熒光的成纖維細(xì)胞，如圖4D。

圖4 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（×200，標(biāo)尺代表50μm）
（A1，B1，C1，D1）為細(xì)胞在自然光下觀察的結(jié)果
（A2，B2，C2，D2）為Hoechst333258 核染色結(jié)果
（A3，B3，C3，D3）為desmin 染色結(jié)果
（A4，B4，C4，D4）為細(xì)胞核染色和desmin 染色的復(fù)合圖

4 討論

20 世紀(jì)70 年代，Richler 等建立起了分離和體外培養(yǎng)原代衛(wèi)星細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。分離方法主要有組織塊法、酶消化分離法等，而酶消化分離法主要有膠原酶、胰蛋白酶、鏈酶蛋白酶、中性蛋白酶及2 或3 種酶并用法等。在這些酶消化法中，研究者多采用膠原酶和胰酶分步消化或混合酶聯(lián)合消化的方法進(jìn)行衛(wèi)星細(xì)胞的分離。采用膠原酶和胰蛋白酶分步消化法需要酶消化時(shí)間比較長(zhǎng)，一般需要50～70min。本實(shí)驗(yàn)也采用了膠原酶和胰蛋白酶組成的混合酶對(duì)牛胎兒骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行消化分離，在消化過(guò)程中，膠原酶使肌束肌纖維相互分離，而分散酶使肌衛(wèi)星細(xì)胞從肌纖維上分離下來(lái)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用混合酶僅需45min 即可使肌纖維相互分離并將骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞從肌纖維上消化下來(lái)，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間，同時(shí)消化時(shí)間的縮短可減少酶消化對(duì)細(xì)胞造成的損傷。

為了確定消化下來(lái)的細(xì)胞是否為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，需要對(duì)獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)蛋白(desmin) 是較早表達(dá)的肌源性標(biāo)志蛋白之一，它是肌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架中間絲的構(gòu)成成分，體外培養(yǎng)形態(tài)類似于衛(wèi)星細(xì)胞的成纖維細(xì)胞不表達(dá)這種蛋白，因此，結(jié)蛋白是鑒定肌衛(wèi)星細(xì)胞的標(biāo)志蛋白之一?[11-12]。消化下來(lái)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中摻雜有大量的成纖維細(xì)胞，如何從中純化骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離的熱點(diǎn)。利用免疫磁珠分選技術(shù)、流式細(xì)胞分選技術(shù)和平面黏附分離法等技術(shù)可獲得高純度的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，但由于很多部門都缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，并且實(shí)驗(yàn)所需抗體等試劑價(jià)格非常昂貴，使這種方法的廣泛應(yīng)用受限?[13]。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室，人們通常采用差速貼壁的方法純化骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，但這種方法也無(wú)法獲得高純度的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。人們?cè)谂囵B(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞時(shí)所用的培養(yǎng)基主要是DMEM 培養(yǎng)基，在這種培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)往往形成成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。而Thomas A.Rando 等對(duì)小鼠骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行分離時(shí)采用Ham's F-10 培養(yǎng)基對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在Ham's F-10 培養(yǎng)基中骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞比成纖維細(xì)胞優(yōu)先生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞不斷得到富集。L.Zhang 等利用Ham's F-10 培養(yǎng)基對(duì)綿羊骨骼肌成肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得出隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Ham's F-10 培養(yǎng)基也能使綿羊骨骼肌成肌細(xì)胞富集的結(jié)論?[14]。本實(shí)驗(yàn)利用混合酶對(duì)胎牛骨骼肌進(jìn)行消化，用DMEM 及Ham's F-10 分別對(duì)消化下來(lái)的混有成纖維細(xì)胞的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行純化，然后用DMEM 及Ham's F-10 對(duì)純化的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，比較了兩種培養(yǎng)基對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的影響，結(jié)果顯示，用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)2d 肌細(xì)胞會(huì)相互融合，7d 后完全融合形成較粗的肌管，而利用Ham's F-10 培養(yǎng)基對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞90%以上的細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，只有很少數(shù)處于分化狀態(tài)，并相互融合形成較細(xì)的肌管，同時(shí)，Ham's F-10 培養(yǎng)基能抑制成纖維細(xì)胞的增殖，因此，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞得到純化，這樣非常有利于在基因工程實(shí)驗(yàn)中對(duì)在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)研究。Ham's F-10 培養(yǎng)基對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用機(jī)理及對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化融合的抑制作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用混合酶消化法及差速貼壁法分離培養(yǎng)得到高純度牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。分離得到的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中不需要分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞就可進(jìn)行分化融合成肌管；在含15%胎牛血清的Ham's F-10 培養(yǎng)基中，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞90%以上的可不斷進(jìn)行增殖而不發(fā)生分化融合，同時(shí)，Ham's F-10 培養(yǎng)基可抑制成纖維細(xì)胞的增殖，因此，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，用Ham's F-10 培養(yǎng)基可進(jìn)一步對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行純化。

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