? ? ? ?大家好， 今天要跟大家分享最近發(fā)表在 Nature methods 上的一篇利用單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)進(jìn)行類器官內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析的一篇文章，題目為：?“Cell-type-specific signaling networks inheterocellular organoids”，通訊作者是來(lái)自倫敦大學(xué)學(xué)院癌癥研究所的 Christopher J. Tape.。

? ? ?《自然-方法》 將單細(xì)胞多模態(tài)組學(xué)評(píng)選為 2019 年度技術(shù)，在這樣的背景下，這篇文章的創(chuàng)新點(diǎn)就在于在單細(xì)胞層面對(duì)細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)， PTM 翻譯后修飾等角度進(jìn)行綜合分析，從而對(duì)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)包括細(xì)胞微環(huán)境產(chǎn)生新的理解與闡述。
? ? ? ?類器官是一類可以自主生長(zhǎng)的三維體外組織模型， 由于其生長(zhǎng)環(huán)境與包含的細(xì)胞類型與母體組織十分相似， 并且保留了細(xì)胞間的相互作用， 與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)模式相比，類器官可以更準(zhǔn)確的反映母體組織的生理特征，也因此被越來(lái)越多的生物學(xué)家利用進(jìn)行體外疾病模型的模擬。
? ? ? ?蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM） 信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的紊亂與疾病的發(fā)生密切相關(guān)， 因?yàn)椴煌?xì)胞類型具有不同特征的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)， 因此類器官也應(yīng)該具有與其生物學(xué)功能密切相關(guān)的細(xì)胞類型特異的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因?yàn)轭惼鞴偈窃隗w外富含蛋白的胞外基質(zhì)（ECM） 中生長(zhǎng)的， 因此直接研究會(huì)對(duì)蛋白層面上的研究造成很大干擾， 而通過(guò)物理切割的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)與基質(zhì)的分離，又很難保持細(xì)胞的原始狀態(tài)，并且常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究無(wú)法解釋類器官細(xì)胞類型間的特異性，因此在單細(xì)胞層面上對(duì)類器官進(jìn)行原位、細(xì)胞特異性以及多通道的 PTMs 研究就變得十分重要。
? ? ? ?基于此，作者發(fā)展了一種多變量的編碼質(zhì)譜流式技術(shù)（multivariate-barcoded MC）來(lái)分析單細(xì)胞層面的類器官的 PTM 信號(hào)網(wǎng)絡(luò)（如圖 1 所示） ，并繼而揭示了腫瘤微環(huán)境與致癌基因突變對(duì)細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)所產(chǎn)生的影響。首先作者分別利用?127IdU、 PHH3 以及 cyclin B1 來(lái)標(biāo)記小腸類器官細(xì)胞的不同周期，再用胰酶以及磷酸酶來(lái)處理消化 ECM， 消化結(jié)束后使用抑制劑抑制兩種酶的活性，再用多聚甲醛（PFA） 進(jìn)行固定，保持細(xì)胞狀態(tài)， 再加入順鉑來(lái)對(duì)活細(xì)胞以及死細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分染色，分離成單細(xì)胞狀態(tài)后孵育與細(xì)胞類型以及 PTM 相關(guān)的抗體， 之后就是經(jīng)典的質(zhì)譜流式流程， 從而可以獲得 PTM、細(xì)胞類型以及細(xì)胞狀態(tài)的多維信息。

? ? ? ?獲得的多維信息，作者通過(guò) UMAP 的算法對(duì)其進(jìn)行降維可視化處理，從中作者發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞以及 Paneth cells 大部分具有增殖能力，而分化的上皮細(xì)胞則更多處于分裂期后或者凋亡狀態(tài)。因此該方法可以提供關(guān)于大量細(xì)胞類型以及狀態(tài)特異性的眾多信息。之后作者又利用相同算法分析了細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)與參與各種信號(hào)通路的 PTMs 之間的關(guān)系（如圖 2） ，并且利用 EMD 以及 DREMI 兩種計(jì)算指標(biāo)來(lái)對(duì) PTM 的相對(duì)強(qiáng)度以及其之間的關(guān)聯(lián)程度進(jìn)行了量化， 作者發(fā)現(xiàn)在所有的類器官細(xì)胞類型中， WNT 信號(hào)通路中的 pGSK-3β [S9]與非磷酸化的 β-Catenin 均被抑制，而在經(jīng)典的理論中， WNT 信號(hào)主要是由蛋白間相互作用驅(qū)動(dòng)，而與 PTM 無(wú)關(guān)， 除此之外，作者還發(fā)現(xiàn)了 MAPK 以及 PI3K 代謝通路具有明顯的細(xì)胞類型特異性?？傊?通過(guò)該研究可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類型以及狀態(tài)與信號(hào)網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)。

? ? ? ?在此基礎(chǔ)上，為了研究健康組織與疾病組織之間的分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)， 同時(shí)分析多種類器官，作者進(jìn)一步發(fā)展了原位的巰基反應(yīng)活性的類器官編碼策略（TOBis） （如圖 3） ， 這種方法可以不受胞外基質(zhì)的影響，原位結(jié)合基質(zhì)中的類器官，并且作者設(shè)計(jì)了 6 種同位素標(biāo)簽，可以在過(guò)濾掉 cell doublet 的情況下， 對(duì) 20 種不同的樣品進(jìn)行同時(shí)分析，從而可以進(jìn)行樣品之間的同批次比較。

? ? ? ?在此基礎(chǔ)上，作者以直腸癌腫瘤微環(huán)境模型為研究對(duì)象，研究了致癌基因突變以及共培養(yǎng)的細(xì)胞類型對(duì)信號(hào)通路的影響（如圖 4） 。作者通過(guò)不同的突變體與共培養(yǎng)細(xì)胞（如結(jié)腸纖維母細(xì)胞與巨噬細(xì)胞） 的組合，構(gòu)建了 19 種類器官分析樣本，利用 TOBis 方法以及下游的數(shù)據(jù)分析， 作者發(fā)現(xiàn)致癌基因突變與腫瘤微環(huán)境對(duì) PTM 信號(hào)網(wǎng)絡(luò)造成的影響相當(dāng)，但是對(duì)于 PTM 之間的關(guān)聯(lián)性則主要由基因型決定，而非微環(huán)境?；|(zhì)細(xì)胞明顯上調(diào)了突變體中的 PI3K 的信號(hào)通路強(qiáng)度， 因此 PI3K 信號(hào)通路的過(guò)度活化可能是導(dǎo)致 CRC 病人體內(nèi)的高含量基質(zhì)腫瘤細(xì)胞造成的。

? ? ? ?綜上，作者對(duì)類器官單細(xì)胞層面的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了多層面的綜合分析，這也是未來(lái)單細(xì)胞組學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)，即實(shí)現(xiàn)多模態(tài)整體分析，從而得到更為整體與深入的單細(xì)胞信息。其中 TOBis 的方法可以在今后實(shí)現(xiàn)多通量樣品檢測(cè)方面加以借鑒。
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41592-020-0737-8