蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions, PPIs）在細胞生命活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用，相互作用的蛋白可通過形成復(fù)雜的功能性復(fù)合體或參與細胞內(nèi)一系列信號級聯(lián)反應(yīng), 調(diào)控細胞及個體的生命活動。研究蛋白間相互作用的常用方法有酵母雙雜、免疫共沉淀、GST pull down和雙分子熒光互補等。其中，GST pull down作為體外檢測蛋白間相互作用的有效方法，既可用于驗證已知蛋白間的PPIs，也可用作未知PPIs的初始篩選測定法，還能用于尋找與已知蛋白相互作用的未知蛋白。

原理：

GST pull down的主要原理是利用DNA重組技術(shù)將已知蛋白與GST融合，而融合蛋白通過GST（谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶）與固化在載體上的GSH（谷胱甘肽）親和結(jié)合。簡單來說，假定a蛋白和b蛋白可能存在相互作用，將純化的融合GST的a蛋白和純化的b蛋白以及能特異性結(jié)合GST的sepharose beads（瓊脂糖凝珠）混合在一起孵育一定時間，然后洗去未結(jié)合蛋白，煮沸beads進行SDS-PAGE電泳。通過WB檢測結(jié)果，可以看到GST-a蛋白和b蛋白所對應(yīng)的條帶，即表明a蛋白和b蛋白因發(fā)生相互作用而被GST-a pull down（GST對照只顯示一個條帶）。

實驗流程：

實驗步驟：

1. 球珠蛋白體系的制備

1.1. 制備GST-a融合蛋白

（i）將目的蛋白與GST的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21菌株中；

（ii）挑取單個克隆到含有LB培養(yǎng)基（+氨芐）的試管里，37℃培養(yǎng)過夜；

（iii）將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有LB培養(yǎng)基（+氨芐）的錐形瓶中，37℃搖床培養(yǎng)數(shù)小時；

（iv）測定OD600值，達到合適值后加入適當(dāng)濃度IPTG，合適條件下繼續(xù)培養(yǎng)（通常需要進行預(yù)實驗以確定最佳IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和時間）；

（v）誘導(dǎo)適當(dāng)時間后，將菌液分次倒入離心管中，4℃ 離心并棄去上清收集管底菌體，菌體置于-20℃條件，如暫時不用，可將菌體存于-80℃冰箱中；

（vi）室溫凍融菌體，馬上置于冰上，加入細菌裂解液并吹打混勻；

（vii）將混合菌體置于冰上超聲破碎（破碎時間、破碎次數(shù)和間隔時間視具體情況而定）至溶液澄清；

（viii）離心取上清并轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.?制備球珠蛋白體系并純化

（i）在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積GSH-sepharose beads，4℃搖床上緩慢搖動;

（ii）離心棄去上清，GSH-sepharose beads上即結(jié)合GST-a融合蛋白；

（iii）加入預(yù)冷的PBS溶液，輕晃懸浮beads，將sepharose洗滌一次，4℃離心棄去上清，重復(fù)此步驟3次；

（iv）最后一次用移液槍吸走珠子表面液體（注意不要吸走珠子），即可獲得結(jié)合GST-a的beads。

2. b蛋白的制備

2.1. 真核蛋白的提?。?/strong>（i）收集細胞；（ii）細胞裂解與離心；（iii）蛋白提取。

2.2. 溶液預(yù)處理（選做）：將細胞裂解液與GSH- sepharose beads和GST在4℃下孵育。

這一步的目的是從裂解液中預(yù)先清除可非特異性地與GST片段相互作用或僅與beads相互作用的蛋白質(zhì)。如果相互作用主要是通過針對候選相互作用蛋白的抗體來檢測，則不需要用GST或GSH- sepharose beads預(yù)先清除裂解物。但當(dāng)使用35S標(biāo)記的細胞裂解物來鑒定新的蛋白質(zhì)相互作用時，這些步驟可幫助減少背景。當(dāng)檢測與該蛋白抗體相互作用的蛋白時，需要包括“GST +beads”和“beads”對照。

3. 體系孵育與pull down

（i）將結(jié)合有GST-a融合蛋白的beads懸浮在適量體積的緩沖液中，加入細胞裂解液，同時采用結(jié)合有GST蛋白的beads和beads作陰性對照，在搖床上晃動（4℃）；

（ii）4℃離心棄去上清液，加入預(yù)冷緩沖液洗滌beads，重復(fù)此步驟3次；

（iii）吸干beads上液體后，加入蛋白電泳上樣緩沖液沸水浴，放入-20℃冰箱備用。

4.?考染檢測與 WB 驗證

結(jié)果分析：

參考：

[1]?柴政斌,張更林,韓金祥.GST-pulldown技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用[J].中國生物制品學(xué)雜志,2014,27(10):1354-1358.

[2]?Einarson MB, Pugacheva EN, Orlinick JR. GST Pull-down. CSH Protoc. 2007;2007:pdb.prot4757. Published 2007 Aug 1. doi:10.1101/pdb.prot4757

[3] 銘研生物-GST pull down實驗原理與步驟

[4] 鐘鼎生物-GST pull-down實驗流程

[5] 丁香通-大家都在做的GST pull-down實驗

[6] 丁香通-GST-pulldown操作流程

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