細胞凋亡檢測實驗簡介?
凋亡檢測主要用于以下實驗過程：1.研究不同類型的病理標本，包括腫瘤細胞和組織； 2.從促進腫瘤細胞凋亡基因治療的角度進行臨床診斷和治療，新藥開發(fā)，生物制品開發(fā)，腫瘤放療和化療以及探索； 3.進行相關(guān)疾病的早期發(fā)現(xiàn)以及放療和化療效果評估等實驗。

1.凋亡檢測實驗的目的：
1.掌上細胞凋亡細胞的形態(tài)特征
2.通過實驗通過用熒光探針對細胞進行雙重標記來檢測正常的活細胞，凋亡細胞和壞死細胞的方法。

2.細胞凋亡檢測實驗的實驗原理：
? ? ? ?根據(jù)其性質(zhì)，來源和生物學意義，細胞死亡可分為凋亡和壞死不同的兩種類型。細胞凋亡在生活過程中無處不在，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是在某些生理條件下順序發(fā)生的一系列事件的組合。它是一種自主控制，細胞可以根據(jù)某些法律程序終止其生命。細胞凋亡具有可識別的形態(tài)和生化特征。
? ? ? 從形態(tài)上可以看出，凋亡細胞與周圍細胞脫離，然后變成圓形，細胞膜向內(nèi)收縮，細胞質(zhì)濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，細胞核收縮破裂，分布是塊狀或新月形。網(wǎng)狀細胞和細胞膜的進一步融合將細胞分為許多完全包裹的凋亡小體，最終被吞噬細胞吞噬并消化。在細胞凋亡過程中，細胞內(nèi)容物不會在細胞外釋放，不會影響其他細胞，因此不會引起炎癥反應(yīng)。
? ? ? ?在生物化學中，在大多數(shù)細胞凋亡過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，其活性增加。核DNA在核小體的連接處被酶隨機切割，并降解為180-200bp的多個片段或其倍數(shù)。如果對核DNA進行瓊脂糖電泳，則可以顯示出以180-200bp為堿基的DNA階梯的特征。
? ? ? ?相反，壞死是當細胞受到嚴重損害時發(fā)生的細胞死亡。在壞死的早期，細胞失去質(zhì)膜的完整性，各種細胞器腫脹，質(zhì)膜塌陷釋放出內(nèi)含物，引起炎癥反應(yīng)。盡管在壞死過程中核DNA也被降解，但是由于存在各種長度的DNA，碎片無法形成梯形條紋，而是分散的。
? ? ? ?一些輕度的損傷刺激和一些抗腫瘤藥物可以誘導細胞凋亡。通常，這些因素還可以在誘導細胞凋亡的同時誘導細胞壞死，這取決于損傷的嚴重程度和細胞本身對刺激的敏感性。
? ? ? ?頭孢噻嗪（HT）是一種自主研發(fā)的抗腫瘤藥物，對急性髓樣白血病，急性單核細胞白血病等有良好的治療作用。研究表明，HT可以誘導HL-60細胞凋亡2小時，范圍為0.02? 5μg/ ml，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。在該實驗中，以1μg/ ml HT體外誘導培養(yǎng)的HL-60細胞凋亡，少數(shù)細胞也壞死。使用Hoechst33342和碘化丙啶（PI）雙重染色，可以區(qū)分細胞凋亡，壞死和正常細胞。
? ? ? 細胞膜是選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI不能穿過質(zhì)膜。當細胞壞死且質(zhì)膜不完整時，PI進入細胞內(nèi)部，它可以包埋在DNA或RNA中以染色壞死細胞，而不是凋亡細胞和活細胞。一些活細胞染料由于是親脂性物質(zhì)，因此可以跨膜進入活細胞，因此可以對活細胞染色。 Hoechst33342是一種低毒的反應(yīng)性熒光染料。它是二苯并咪唑的衍生物。它特異性結(jié)合DNA（主要結(jié)合到A-T的堿基區(qū)域），顯示凋亡細胞和活細胞?？吹降蛲鲂◇w的任何細胞都是凋亡小細胞。

3.實驗所需試劑和材料：
1.試劑：頭孢噻嗪（HT），300μg/ ml，100mmol / L Tris-HCl（pH7.5），5mol / L EDTA緩沖液，堿性裂解液：0.2mol / L NaOH，1％SDS 2.乙酸鈉：3mol / L KAc（pH 4.8）;異丙醇70％乙醇；溴酚藍，蔗糖指示劑。 TBE緩沖液，1％瓊脂糖，溴化乙錠。 PI母液：500μg/ ml； Ho33342母液：2 mmol / L。
2.儀器和設(shè)備：熒光顯微鏡，電泳儀，電泳槽，微量取樣器（1ml，100μl）0.5、1.5ml離心管，載玻片，蓋玻片

4.凋亡檢測實驗材料：
將人早幼粒細胞白血病HL-60細胞在含有10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中于37°C和5％CO2培養(yǎng)。

5.凋亡檢測方法步驟
1.頭孢噻嗪誘導HL-60細胞凋亡
（1）在實驗前約24小時，接種兩瓶標有①，②的HL-60細胞，每瓶包含約6ml培養(yǎng)基，并在37°C，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（2）實驗前約2.5小時，當細胞密度達到70％時，在燒瓶①中加入頭孢菌素200μl使終濃度為1μg/ ml，在燒瓶②中加入等量的PBS（pH7.4）作為控制。將它們放在培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時。
2. Ho33342和PI雙重染色可識別三種類型的細胞
（1）染色：將瓶中的細胞搖勻，并在1.5ml離心管中加入200μl，加入Ho33342母液2μl，PI20μl，并染色15分鐘。
（2）滴下：用雙面膠帶在玻璃載玻片上形成一個小腔，從離心管中取出10 μl上述染色的細胞懸液，在腔中加入蓋玻片，并在熒光燈下用紫外線激發(fā)顯微鏡在高倍率下觀察，區(qū)分三種細胞，并注意三種細胞的比例。

5.實驗注意事項：
1. HL-60細胞的誘導培養(yǎng)時間應(yīng)準確；
2.在熒光顯微鏡下觀察細胞時，由于熒光脆弱，觀察應(yīng)盡可能快。