支原體（Mycoplasma）又稱霉形體，廣泛分布于自然界（有80余種），為目前發(fā)現(xiàn)的最小最簡(jiǎn)單的細(xì)胞，也是唯一一種沒有細(xì)胞壁的原核細(xì)胞。支原體基因組為一環(huán)狀雙鏈DNA，分子量小，基因數(shù)量為480個(gè)，直徑50-300 nm，能通過細(xì)菌濾器，大小介于細(xì)菌和病毒之間。菌落?。ㄖ睆?.1-1.0 mm），在固體培養(yǎng)基表面呈特有的“油煎蛋”狀。不能維持固定的形態(tài)而呈現(xiàn)多形性，對(duì)滲透壓敏感，對(duì)抑制細(xì)胞壁合成的抗生素不敏感。革蘭氏染色不易著色，故常用Giemsa染色法將其染成淡紫色。

支原體污染

支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種污染。但由于不易被察覺，有些污染的細(xì)胞仍在繼續(xù)使用。據(jù)查，目前各實(shí)驗(yàn)室使用的二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞中約有11%受到支原體污染。因此，對(duì)支原體污染應(yīng)嚴(yán)加防范。支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個(gè)方面來預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。

支原體污染檢測(cè)方法

分離培養(yǎng)法

分離培養(yǎng)法是從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長(zhǎng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì)在這種瓊脂平板上瘋狂生長(zhǎng)，最終形成明顯可見的特征性菌落。分離培養(yǎng)法基本不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。不過分離培養(yǎng)法也存在兩個(gè)弊端：

1、檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)，支原體要長(zhǎng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。

2、盡管它可以檢測(cè)絕大多數(shù)支原體種類，但也有力所不及的時(shí)候，比如分離培養(yǎng)法就不能檢出支原體M. hyorhinis菌株的存在。

如果實(shí)在不想等這么久，或者希望在分離培養(yǎng)法的等待過程中先拿到初步結(jié)果，可以試一試酶學(xué)檢測(cè)法、ELISA法、DNA染色法或PCR法。不過需要注意的是，上述檢測(cè)方法都不能單獨(dú)檢出所有類型的支原體，而且靈敏度也沒有分離培養(yǎng)法高，所以最好結(jié)合使用兩種方法以獲得最可靠的檢測(cè)結(jié)果。

酶學(xué)檢測(cè)法

酶學(xué)檢測(cè)是將可疑樣本添加到特定底物中，在這一體系內(nèi)支原體的酶可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP，隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。

ELISA檢測(cè)法

ELISA也能用于支原體檢測(cè)，以ELISA法為基礎(chǔ)的支原體檢測(cè)一般使用針對(duì)支原體16S rRNA基因的帶標(biāo)記探針或抗體，來檢測(cè)培養(yǎng)物中是否含有支原體。

DNA熒光染色法

需要將可疑樣品與指示細(xì)胞共同培養(yǎng)，因此一般需要幾天時(shí)間。DNA檢測(cè)所用的指示細(xì)胞通常是細(xì)胞質(zhì)區(qū)域較大的Vero細(xì)胞，如果原樣本中含有支原體，那么當(dāng)細(xì)胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時(shí)，就可以在指示細(xì)胞的核周圍觀察到熒光斑點(diǎn)或熒光顆粒。DNA法則可以準(zhǔn)確的將分離培養(yǎng)法不能檢測(cè)的支原體M. hyorhinis菌株檢測(cè)出來。國(guó)際支原體組織（IOM）推薦分離培養(yǎng)法和DNA熒光染色法作為常規(guī)檢測(cè)方法。

但最近PCR法的發(fā)展令人鼓舞

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PCR檢測(cè)法

PCR法檢測(cè)支原體只需幾個(gè)小時(shí)，是最快也是最靈敏的支原體檢測(cè)方法。該方法采用針對(duì)支原體DNA的引物用PCR檢測(cè)可疑樣本，其中PCR引物通常針對(duì)支原體的16S rRNA基因。在凝膠電泳過程中，支原體DNA會(huì)顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。PCR法可以檢測(cè)大多數(shù)支原體，但謹(jǐn)慎起見最好同時(shí)使用另一種檢測(cè)方法來進(jìn)行驗(yàn)證。

普健生物生產(chǎn)的支原體PCR檢測(cè)試劑盒（Mycoplasma PCR Test Kit）是一款具有快速、靈敏、特異性高等特點(diǎn)的支原體檢測(cè)試劑盒，可用于細(xì)胞、培養(yǎng)基、動(dòng)物血清等的支原體檢測(cè)。本產(chǎn)品通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）特異擴(kuò)增支原體16s-rRNA 基因保守區(qū)域片段進(jìn)行支原體檢測(cè)，能夠檢測(cè)包括M. arthritidis， M. hominis，M. hyorhinis，M. fermentans，M. orale，M. salivarium，M. bovis，M. bovigenitalium，M.pneumoniae，M. pirum等在內(nèi)的數(shù)十種支原體。

產(chǎn)品組成

保存條件

-15 ~ -25℃保存，自檢定合格之日起有效期為12個(gè)月。

使用說明

01

收取待檢樣品

貼壁細(xì)胞：待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右即可，使用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞（送檢細(xì)胞不能用消化液消化細(xì)胞）。

懸浮細(xì)胞：待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右即可直接進(jìn)入下一步離心。

注：一般以6孔板接種細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％時(shí)即可取樣進(jìn)行檢測(cè)。培養(yǎng)液中的青霉素和鏈霉素不會(huì)影響檢測(cè)效果。

02

1000 rpm離心5 min，棄上清，留100-200?μl培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，沸水浴10 min。

03

將煮沸的細(xì)胞懸浮液12000 rpm離心3-5 min。

04

所得樣品取4ul直接用于PCR檢測(cè)，或凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

充分融化PCR反應(yīng)液，按照下表配制PCR反應(yīng)體系：

將所有PCR反應(yīng)管放入PCR儀，按照以下參數(shù)運(yùn)行PCR反應(yīng)程序：

05

取5 ul PCR產(chǎn)物（無需再加溴酚藍(lán)），進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳：110V電泳20-30 min，根據(jù)電泳儀情況，適當(dāng)調(diào)整電泳參數(shù)。

支原體陽性細(xì)胞擴(kuò)增片段在270 bp左右

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（M：marker，+：陽性，-：陰性，1-3：檢測(cè)為陽性的細(xì)胞，4-5：檢測(cè)為陰性的細(xì)胞）

使用該試劑盒還有一些

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注意事項(xiàng)

1使用試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書全文。

2為保證結(jié)果可靠性，建議每次實(shí)驗(yàn)都有陽性和陰性對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)各加4μl，陽性對(duì)照隨試劑盒提供，陰性對(duì)照為滅菌ddH2O，需客戶自己準(zhǔn)備。

3操作時(shí)應(yīng)盡量少說話，或帶口罩，因口腔中也含有支原體，可能引起樣品污染，而造成假陽性。

4細(xì)胞培養(yǎng)物中含有青霉素和鏈霉素等抗生物素不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，如果用戶需要進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，建議用不含雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞2-3天后進(jìn)行檢測(cè)。

5本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

6為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。