? ? ? 百螢Annexin V-mFluor Violet 510標記探針是美國AAT Bioques研發(fā)的用于檢測細胞功能的探針，模聯(lián)蛋白是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族。 下面一起來看看它的實驗方案是怎樣的。

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一、 百螢 Annexin V-mFluor Violet 510標記分析方案概述

用測試化合物（200μL/樣品）制備細胞

添加Annexin V結(jié)合物測定溶液

室溫孵育30-60分鐘

用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析

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二 百螢 Annexin V-mFluor Violet 510標記實驗操作步驟

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細胞：

1.1制備膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。

1.2用測試化合物處理細胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的Jurkat細胞4-6小時）以誘導(dǎo)細胞凋亡。

1.3離心細胞，得到1-5×105個細胞/管。

1.4將細胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液中（來自步驟1.1）。

1.5在細胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。

可選：在細胞內(nèi)加入死細胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細胞。

1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。

1.7在用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，加入300μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）以增加體積（參見下面的步驟1.8）。

1.8使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強度（參見下面的步驟2或3）。

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2.使用流式細胞儀分析：

通過使用具有適當(dāng)過濾器的流式細胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細胞上的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合流式細胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。 然而，Casiola-Rosen等人先前報道了利用膜聯(lián)蛋白V對貼壁細胞類型進行流式細胞術(shù)的方法。 和van Engelend等人（見參考文獻1和2）。

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3.使用熒光顯微鏡分析：

3.1移取步驟1.6的細胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）重懸細胞。 將細胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對于粘附細胞，建議直接在蓋玻片上生長細胞。 與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細胞。 在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。

3.2在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細胞

以上就是百螢 Annexin V-mFluor Violet 510標記的實驗方案，大家可以跟著操作起來啦。