2022 年 2 月 26 日，河南大學(xué)棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室孫旭武課題組在 Plant Journal (IF: 6.417) 發(fā)表了題為 Identification of Novel Regulators Required for Early Development of Vein Pattern in the Cotyledons by Single-cell RNA-seq 的研究論文，系統(tǒng)地分析了擬南芥幼苗生長(zhǎng)初期子葉葉脈的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，鑒定了關(guān)鍵的標(biāo)記基因，并構(gòu)建了特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

歐易生物在本研究中承擔(dān)了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析工作。

研究背景

植物的維管組織是由木質(zhì)部和韌皮部組成的輸導(dǎo)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并有一定支持功能的植物組織[1]。在植物進(jìn)化過(guò)程中，維管組織的分化和出現(xiàn)，對(duì)于植物適應(yīng)陸生環(huán)境具有重大意義。水分在木質(zhì)部向上運(yùn)輸，木質(zhì)部由管胞和導(dǎo)管組成。有機(jī)溶質(zhì)在韌皮部中雙向運(yùn)輸，韌皮部含有缺乏細(xì)胞核的活性篩管元素和有細(xì)胞核的伴細(xì)胞。此外，維管系統(tǒng)通常被薄壁細(xì)胞束鞘包圍[2]。

在發(fā)育上，莖頂端分生組織和根頂端分生組織產(chǎn)生的原形成層細(xì)胞在初生生長(zhǎng)期間產(chǎn)生初生韌皮部和初生木質(zhì)部[1]。氣管分化抑制因子(TDIF)，一種 CLAVATA3/ESR 相關(guān)(CLE)家族肽 CLE41/CEL42/CEL44，作為信號(hào)分子，既能抑制木質(zhì)部細(xì)胞從原形成層細(xì)胞的分化，又能促進(jìn)原形成層細(xì)胞增殖。響應(yīng)生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和TDIF信號(hào)，TDIF的受體 TDR/PXY 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)調(diào)控微管的發(fā)育[3-5]。在葉片和子葉中，葉脈模式的形成是通過(guò)將基礎(chǔ)細(xì)胞逐漸招募到原形成層細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)的[6]。種子萌發(fā)后，子葉快速發(fā)育產(chǎn)生葉綠體，并通過(guò)光合作用為幼苗的生長(zhǎng)和存活提供能量。隨著子葉的發(fā)育，在子葉中的葉脈快速出現(xiàn)。它們構(gòu)成了幼苗中光合產(chǎn)物和礦物質(zhì)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵通道網(wǎng)絡(luò)。盡管已有大量的研究試圖解析在幼苗發(fā)育早期子葉中葉脈的發(fā)育調(diào)控機(jī)制，但由于組織分離技術(shù)的局限性，至今仍然難以完全理解。最近，single cell RNA-Seq(scRNA-seq)技術(shù)已經(jīng)在解析植物氣孔的發(fā)育和根系的發(fā)育中得到了快速的應(yīng)用[7]，并且在解析成熟葉片的韌皮薄壁組織的發(fā)育和功能中得到了應(yīng)用[8]。但是關(guān)于幼苗生長(zhǎng)初期，在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組層面關(guān)于子葉中的葉脈的發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

研究?jī)?nèi)容

為了分析子葉葉脈早期發(fā)育和分化的調(diào)控機(jī)制，該研究使用單細(xì)胞RNA測(cè)序分析了14117個(gè)來(lái)自3天齡子葉的單細(xì)胞?；诨虮磉_(dá)模式,共鑒定到了 10 個(gè)細(xì)胞簇。通過(guò)分析已知標(biāo)記基因的表達(dá)模式，對(duì)所鑒定的細(xì)胞簇進(jìn)行了細(xì)胞類型的注釋(圖 1)。

圖 1 | 子葉葉脈細(xì)胞類型的鑒定。

(a)所有細(xì)胞的 tSNE 圖。圖上每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，不同的染色代表不同的細(xì)胞類型的細(xì)胞。BS：束鞘；MPC：葉肉細(xì)胞；PP：韌皮薄壁組織；HD：水孔；CC：伴細(xì)胞；GC：保衛(wèi)細(xì)胞；EP：表皮；XP：木質(zhì)部薄壁組織；PCxp：木質(zhì)部薄壁組織細(xì)胞，具有與木質(zhì)部分化有關(guān)的特征；PCpp：原形成層細(xì)胞，具有韌皮部分化的特征；SE：篩元；u.k.未知的細(xì)胞類型。

(b)tSNE 圖中每個(gè)簇中特異表達(dá)的前10個(gè)基因的熱圖。

(c)每個(gè)細(xì)胞簇中代表性標(biāo)記基因的特征圖。

在確定了細(xì)胞類型的基礎(chǔ)上，研究進(jìn)一步篩選了一些在特定組織和細(xì)胞中表達(dá)的標(biāo)記基因。通過(guò)分析部分標(biāo)記基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因的表達(dá)模式證明，這些標(biāo)記基因主要是在子葉的葉脈中表達(dá)(圖 2)。這些標(biāo)記基因的鑒定為將來(lái)進(jìn)一步研究和分析鑒定微管組織細(xì)胞提供了重要的參考基因。

圖 2 | 分析代表性靜脈標(biāo)記基因的表達(dá)。

(a)在子葉中檢測(cè)到具有代表性的葉脈標(biāo)記基因的GUS信號(hào)。比例尺:200微米。

(b)檢測(cè)野生型(wild type: WT)3 天齡幼苗中的GUS活性。比例尺:1000微米。

為了進(jìn)一步分析子葉葉脈的發(fā)育調(diào)控機(jī)制，研究進(jìn)一步分析了特定組織細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖 3)。如圖 3a-c 所示，在 PP、CC_4 和 XP 中鑒定到的核心轉(zhuǎn)錄因子分別是CDF5、ERF15 和 RGA。進(jìn)一步 DNA 親和純化測(cè)序(DAP-seq)分析表明，CDF5 在 BZIP9、SWEET12 和 SULTR2;1 的啟動(dòng)子區(qū)域以及 SWEET11 的編碼序列(CDS)區(qū)域顯著富集(圖3e-g)，表明這些基因的表達(dá)可由 CDF5 調(diào)節(jié)。對(duì) CDF5 靶基因的 GO 分析表明，它們主要參與調(diào)解激素刺激、韌皮部或木質(zhì)部組織發(fā)生和晝夜節(jié)律(圖3h)。為了更好地理解CDF5在PP發(fā)育中的潛在作用，研究篩選了cdf5突變體。如圖3i所示，cdf5 突變體中靜脈的發(fā)育模式與WT相似。然而在cdf5突變體中，相比WT 而言，BZIP9、SWEET11、SWEET12 和 SULTR2;1的表達(dá)發(fā)生了不同程度地下降(圖 3j)，表明CDF5可能通過(guò)調(diào)節(jié)這四個(gè)靶基因的表達(dá)參與調(diào)節(jié)葉脈的功能。事實(shí)上，已有研究表明，這些基因主要參與調(diào)節(jié)葉脈的功能，而不是其發(fā)育[8-10]。

圖 3 | 不同細(xì)胞類型中轉(zhuǎn)錄因子(TFs)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的鑒定。

(a)–(c)顯示PP、CC_4 和XP 細(xì)胞潛在核心轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。圓點(diǎn)大小表示連接的數(shù)量。顯示了排名靠前的節(jié)點(diǎn)（按連接數(shù)排序）的基因名稱。

(d)–(g)在代表性基因的啟動(dòng)子區(qū)域富集CDF5的 DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq)分析。(h)CDF5 靶基因的 GO 富集分析。

(i)檢測(cè) cdf5 突變體和野生型(WT)幼苗 3 天齡幼苗子葉維管系統(tǒng)的發(fā)育模式。比例尺：500 m.

(j)CDF5 突變體和WT中CDF5代表性靶基因相對(duì)表達(dá)的qPCR 分析。*: p<0.01，***: p<0.001，student t 檢驗(yàn)與WT。

研究結(jié)論

綜上所述，本研究所獲得的結(jié)果為研究子葉葉脈的早期轉(zhuǎn)錄組圖譜提供了新的見(jiàn)解，并有助于識(shí)別葉脈細(xì)胞的新標(biāo)記基因。這些新標(biāo)記基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式通過(guò)GUS報(bào)告融合進(jìn)一步得到證實(shí)，為葉脈發(fā)育的機(jī)制提供了新的信息。在未來(lái)的研究中使用這些新標(biāo)記，可以更完整地了解葉脈發(fā)育的機(jī)制。

河南大學(xué)農(nóng)學(xué)院劉祉辛副教授和棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室孫旭武課題組的碩士生王佳靜為論文的共同第一作者，孫旭武教授為通訊作者。上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司總經(jīng)理肖云平，技術(shù)人員陸瑤在數(shù)據(jù)分析中給予了大力的支持。該研究得到了國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目和河南大學(xué)高層次人才啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)的支持。

孫旭武教授課題組近年來(lái)在植物葉片單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序領(lǐng)域取得了一系列重要的研究進(jìn)展，解析了擬南芥氣孔系細(xì)胞早期發(fā)育的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜(Liu et al, 2020, Mol Plant)和干旱與鹽脅迫條件下幼苗表皮細(xì)胞發(fā)育的動(dòng)態(tài)模式(Liu et al, 2022, Int J Mol Sci)。

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