單細胞轉(zhuǎn)錄組多組學(xué)助力解析砷烯納米片在腫瘤微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)
前言
2022年9月12日，來自南京大學(xué)化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院的團隊，于ACS Applied Materials & Interfaces（IF：10.383）在線發(fā)表了砷烯納米片在腫瘤微環(huán)境中免疫調(diào)節(jié)作用的最新研究成果。該研究通過體內(nèi)和體外實驗，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序(scRNA-seq)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，全面闡釋了砷烯在腫瘤微環(huán)境中的作用機制，首次發(fā)現(xiàn)砷烯的免疫調(diào)節(jié)作用，為未來的免疫治療提供了一個很有前途的策略。
研究背景
砷烯是一種由坤烯組成的二維單元素層狀納米片，具有顯著的抗癌活性，但具體的生物學(xué)機制仍是未知的。通過單細胞轉(zhuǎn)錄組分析腫瘤微環(huán)境中的細胞表型，該研究發(fā)現(xiàn)砷烯可以招募高比例的抗癌免疫細胞，重塑腫瘤微環(huán)境，從而清除腫瘤。在體內(nèi)，砷烯可以激活T細胞受體信號通路來產(chǎn)生抗腫瘤免疫細胞，并抑制腫瘤細胞的DNA復(fù)制和TCA循環(huán)通路。腫瘤細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，砷烯通過靶向硫氧化還原蛋白TXNL1來誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生和氧化應(yīng)激損傷。在瀕死的腫瘤細胞中，超負荷的活性氧（ROS）進一步觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）和“吃我”信號，激活抗原呈遞過程，誘導(dǎo)后續(xù)效應(yīng)腫瘤特異性CD8T細胞免疫反應(yīng)。該研究首次發(fā)現(xiàn)，二維無機納米材料砷烯可以有效激活直接的抗癌免疫反應(yīng)，表明砷烯可以作為未來抗腫瘤免疫治療的候選納米藥物。
基本信息
期刊：ACS Applied Materials & Interfaces
影響因子：10.383
發(fā)表年月：2022年9月12日
材料：砷烯和PBS處理過的U14荷瘤小鼠腫瘤組織
方法：10X Genomics高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序
研究結(jié)果
1.砷烯對宮頸癌的體內(nèi)、體外抗腫瘤作用
作者采用液體超聲剝離法合成了二維砷烯納米片，平均尺寸為138.4 nm，尺寸分布范圍約為84.7 ~ 198.4 nm。用透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)、拉曼光譜和寬掃描x射線光電子能譜(XPS)以及原子力顯微鏡(AFM)對納米片進行了表征(圖1a?c)。作為活性氧(ROS)靶向的納米材料，砷烯已被報道能產(chǎn)生類似芬頓的反應(yīng)性質(zhì)。在不同濃度的砷處理后，1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)和亞甲基藍(MB)降解顯著，證實了砷烯納米片催化的類芬頓反應(yīng)(圖1d)。
在24、48、72 h檢測不同濃度的砷烯對小鼠宮頸癌細胞系U14、小鼠乳腺癌細胞系4T1、小鼠胃癌細胞系MFC、小鼠正常細胞系MC3T3-E1和NCTC -1469的細胞毒性。結(jié)果表明，砷烯在24 h時對U14細胞的抑制作用最強，IC50值為0.5798 μg/mL，而在低濃度時對正常細胞系NCTC-1469無毒性(圖1e - f)?？紤]到砷烯在體外催化的類芬頓反應(yīng)，作者研究了細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。通過流式細胞術(shù)檢測，在砷烯處理后U14癌細胞中觀察到ROS的爆發(fā)產(chǎn)生，而正常NCTC-1469細胞中未觀察到ROS的產(chǎn)生（圖1h）。此外，作者還使用陽離子脂類熒光染料(JC-1)檢測了線粒體跨膜電位(MMP)，對U14細胞中形成的單體和聚集體的成像顯示，線粒體去極化是由砷烯誘導(dǎo)的(圖1g)。凋亡實驗證實了砷烯在U14細胞中誘導(dǎo)凋亡細胞死亡(圖1i)。
鑒于砷烯在細胞內(nèi)具有良好的抗癌作用，作者研究了其在體內(nèi)的抗腫瘤活性。在BALB/c雌性小鼠中構(gòu)建小鼠U14腫瘤模型，注射砷烯納米片(1.5 mg kg)。注射后24 h，觀察到腫瘤組織中砷烯的生物分布(圖1j)。與PBS組相比，砷烯組表現(xiàn)出了優(yōu)異的抗腫瘤效果(圖1k?l)。砷烯對腫瘤的相對抑制率約89%，小鼠20天存活率為100%(圖1m)。腫瘤切片的H&E染色也顯示出砷烯的顯著抑制作用(圖1n)。
圖1 | 砷納米片的表征及其抗腫瘤活性
2. 對腫瘤微環(huán)境進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，揭示砷烯的免疫激活作用
為了更好地說明砷烯在腫瘤微環(huán)境中的作用，作者對砷烯和PBS處理過的小鼠腫瘤組織進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序 (圖2a)。初步質(zhì)量控制后，PBS組獲得12344個細胞，砷烯組獲得10598個細胞?；诨虮磉_譜的主成分分析，識別出了17個具有特定基因表達譜的細胞簇。砷烯處理后腫瘤微環(huán)境中免疫細胞富集比例較高，PBS處理后腫瘤區(qū)免疫細胞富集比例較低(圖2b)。在砷烯處理組中，T細胞占41.51%，B細胞占20.5%，NK細胞占8.96%，巨噬細胞占6.75%，腫瘤上皮細胞占2.46%。而PBS組中，腫瘤中上皮細胞的比例為87.25%，免疫細胞的比例僅為0.25%，B細胞比例為0.03%，并未觀察到NK細胞(圖2c)。表明，砷烯通過增強先天(NK細胞、B細胞和巨噬細胞的募集)和適應(yīng)性(T細胞的募集)免疫反應(yīng)，在重構(gòu)腫瘤微環(huán)境中具有有效的免疫調(diào)節(jié)作用。
為了揭示基因水平的潛在機制，比較PBS組和砷烯組的表達基因水平。通過KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)砷烯處理后小鼠的抗原加工和遞呈、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路和自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性均被激活，提示砷烯具有明顯的免疫激活能力(圖2d)。GSEA分析結(jié)果顯示，砷烯激活的基因主要與抗原加工呈遞途徑、Th1和Th2細胞分化、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性過程和T細胞受體信號通路有關(guān)(圖2e)。砷烯在腫瘤上皮細胞中顯著抑制DNA復(fù)制、RNA運輸、丙酮酸代謝和TCA循環(huán)過程(圖2f)。抑制DNA復(fù)制和RNA運輸直接限制了腫瘤細胞增殖，而砷烯對TCA循環(huán)過程中丙酮酸代謝的影響導(dǎo)致腫瘤呼吸鏈中斷，能量耗盡。
綜上所述，砷烯通過招募免疫T細胞、B細胞、NK細胞和巨噬細胞，增強腫瘤微環(huán)境中的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，具有高效的免疫調(diào)節(jié)能力。
圖2 |?小鼠腫瘤微環(huán)境的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析
3.體外和體內(nèi)實驗證實砷烯的免疫激活作用
如scRNA-seq所示，在腫瘤微環(huán)境中，砷烯激活抗原呈遞和T細胞受體信號通路。在樹突細胞（DC）成熟過程中，未成熟DC (iDCs)吞噬腫瘤釋放到特殊受體的抗原。為了確定DC的激活過程，作者在體外檢測DC的成熟，將砷烯處理的U14癌細胞與從BALB/c雌性小鼠骨髓中提取的iDCs共培養(yǎng)(圖3a)。在Transwell系統(tǒng)中，U14細胞在上孔中培養(yǎng)，用砷烯處理6 h，然后與下孔中接種的iDCs共培養(yǎng)24 h。收集DC，檢測DC成熟標記共刺激分子CD86和CD80的表達。結(jié)果顯示，與PBS相比，砷烯顯著促進DC (CD86/CD80)的成熟度，從0.8%提高到23.3%(圖3c)。ELISA結(jié)果顯示，砷烯顯著促進了DC激活相關(guān)細胞因子TNF-α和白細胞介素-12 (IL12p70)的分泌 (圖3b)。這些結(jié)果表明，砷烯能成功地在體外誘導(dǎo)DC成熟。
然后，作者評估了砷烯在體內(nèi)的抗癌免疫激活。免疫小鼠構(gòu)建U14腫瘤模型，尾靜脈注射砷烯處理24 h后，收集腫瘤引流淋巴結(jié)，流式細胞術(shù)分析DC的成熟情況。成熟DC的表達量從0.855%增加到33.7%(圖3d)，而且砷烯也能促進白細胞介素12的分泌(圖3e)。這些結(jié)果表明，砷烯能有效地觸發(fā)體內(nèi)抗原呈遞過程。進一步檢測效應(yīng)CD4 T細胞和CD8 T細胞，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，PBS和砷烯處理小鼠CD4 T細胞的百分比分別為3.82%和6.26%，CD8 T細胞的比例分別為1.98%和10.21%(圖3f,g)。與PBS組相比，砷烯組T細胞數(shù)量減少到約7.12%（圖3h,i），說明砷烯可以有效改善免疫抑制微環(huán)境。這些結(jié)果表明，砷烯能誘導(dǎo)效應(yīng)抗腫瘤T細胞在腫瘤微環(huán)境中的募集，這與scRNA-seq分析顯示的大量T細胞在腫瘤微環(huán)境中的募集一致。另外，作者不但證實砷烯可以激活的DC和T細胞，又進一步證實了巨噬細胞的極化。
圖3 | 體內(nèi)外實驗證實砷的免疫激活作用
4. 砷烯處理誘導(dǎo)的免疫記憶反應(yīng)
為了進一步確定砷烯誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫記憶反應(yīng)，作者采集脾臟并檢測記憶相關(guān)T細胞的變化。在小鼠中，根據(jù)CD44和CD62L的表達，記憶T細胞可分為na?ve和記憶細胞。記憶T細胞通過CD44高表達和CD62L低表達進行鑒定。與野生型小鼠相比，砷烯處理小鼠脾臟的na?ve T細胞比例降低，而效應(yīng)記憶T細胞(TEM)和中樞記憶T細胞(TCM)則明顯增加(圖3j)。此外，對于砷烯治療的U14荷瘤BALB/c小鼠，當(dāng)?shù)诙文[瘤植入7天后，具有免疫記憶的小鼠均未出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，而野生型小鼠腫瘤復(fù)發(fā)(圖3k,l)。這些數(shù)據(jù)表明，砷烯確實可以誘導(dǎo)強烈的免疫記憶反應(yīng)，有效地防止腫瘤的復(fù)發(fā)。砷烯處理后產(chǎn)生的有效抗癌T細胞和免疫記憶顯示了砷烯在未來生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中強大的免疫治療潛力。
5. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示砷烯在癌細胞中的作用機制
為了探索上述觀察到的免疫激活，作者對U14腫瘤細胞進行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。經(jīng)砷烯處理后，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)細胞中存在顯著差異表達的蛋白。其中，增加了146個蛋白的表達，減少了154個蛋白質(zhì)的表達(圖4a)。有趣的是，U14細胞中表達下調(diào)的Top蛋白是硫氧還蛋白樣蛋白-1 (TXNL1)，這是一種具有二硫氧化還原酶活性的硫氧還蛋白，參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，保護細胞免受氧化損傷。TXNL1表達的快速下調(diào)導(dǎo)致癌細胞發(fā)生氧化還原紊亂和急性細胞凋亡，不可避免地導(dǎo)致癌細胞氧化還原失衡。因此，砷烯誘導(dǎo)的ROS爆發(fā)可能與細胞內(nèi)TXNL1蛋白失活有關(guān)。Western blot實驗證實，由此產(chǎn)生的氧化應(yīng)激進一步提高了保護蛋白HMOX1和hsp70的表達(圖4c)。
為進一步分析砷烯對癌細胞細胞通路的影響，作者進行了生物信息學(xué)分析。KEGG分析表明，砷烯能激活抗原呈遞過程和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程 (圖4b)。由此可見，在蛋白質(zhì)組水平上，在癌細胞中，砷烯抑制硫氧還蛋白TXNL1產(chǎn)生致死性氧化應(yīng)激，并進一步激活氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的過表達，參與ER過程和抗原呈遞途徑。
ROS的產(chǎn)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激對激活細胞內(nèi)免疫原性細胞死亡(ICD)途徑至關(guān)重要。ICD依賴于誘導(dǎo)腫瘤細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，結(jié)合細胞凋亡和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)的釋放，促進抗腫瘤免疫反應(yīng)。在這一ICD過程中，ROS激活了DAMP信號通路，包括暴露在細胞表面的鈣網(wǎng)蛋白(CRT)、釋放高遷移率組蛋白(HMGB1)和凋亡分泌ATP。從砷烯誘導(dǎo)的細胞死亡的形態(tài)中可以觀察到死亡細胞和內(nèi)源性內(nèi)容物的釋放(圖4d)。然后，通過分析培養(yǎng)基中釋放的內(nèi)容，檢測砷烯處理癌細胞的培養(yǎng)基上清液中ATP、HMGB1等DAMPs的釋放(圖4e,f)。
此外，熱休克蛋白70 (HSP70)和ICD標記鈣網(wǎng)蛋白等DAMP在砷處理的死亡細胞中過表達(圖4g)。CRT作為ICD的指標，以及“吃我”信號，刺激iDCs和巨噬細胞吞噬死亡腫瘤細胞的碎片。免疫熒光進一步驗證顯示，U14細胞中CRT表達顯著升高(圖4h)。HMGB1作為一種危險信號，可刺激樹突狀細胞的吞噬。與未處理的細胞核中HMGB1的綠色信號相比，砷烯能顯著誘導(dǎo)U14細胞中HMGB1的胞外釋放（圖4i）。這些結(jié)果表明，砷烯可誘導(dǎo)免疫原性細胞死亡和DAMPs釋放，釋放的DAMPs進一步誘導(dǎo)抗原提呈細胞成熟。
圖4 | 砷烯處理U14癌細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析、ICD誘導(dǎo)和DAMP釋放
總的來說，在癌細胞中，砷烯通過靶向TXNL1誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激損傷。超負荷的ROS進一步觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，瀕死腫瘤細胞釋放DAMPs和“吃我”信號，從而激活抗原提呈過程，進而促進抗原提呈DCs的成熟，誘導(dǎo)后續(xù)的效應(yīng)性腫瘤特異性T細胞免疫反應(yīng)(圖5)。
圖5 | 通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析和單細胞測序分析，分別繪制了砷烯在癌細胞和腫瘤微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)過程示意圖，揭示了砷烯納米片意想不到的免疫調(diào)節(jié)潛力
研究結(jié)論
作者通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，全面分析了砷烯在體內(nèi)和體外的作用機制，首次發(fā)現(xiàn)了砷烯意想不到的免疫調(diào)節(jié)能力。腫瘤組織的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析顯示，砷烯通過在腫瘤區(qū)域招募高比例的免疫細胞，重塑了腫瘤微環(huán)境。腫瘤細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，砷烯通過靶向硫氧化還原蛋白TXNL1來誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生和氧化應(yīng)激損傷。在瀕死的腫瘤細胞中，超負荷的活性氧（ROS）進一步觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）和“吃我”信號，激活抗原呈遞過程，誘導(dǎo)后續(xù)效應(yīng)腫瘤特異性CD8T細胞免疫反應(yīng)。
因此，體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)源于砷烯處理死亡癌細胞釋放的特殊信號，這一過程進一步觸發(fā)了初始和適應(yīng)性免疫反應(yīng)；這一意外發(fā)現(xiàn)首次表明，二維單元素材料可以有效激活直接的抗癌免疫反應(yīng)，為未來的免疫治療提供了一個很有前途的策略。
詳細技術(shù)請訪問歐易生物官網(wǎng)
?
百度搜索歐易生物（oebiotech）
?
了解更多多組學(xué)技術(shù)
（單細胞轉(zhuǎn)錄組測序、單細胞測序、流式細胞、蛋白質(zhì)組學(xué)）
猜你想看
1、探"云"指南 | 降維新成員：NMDS分析
2、ACTA PHARM SIN B | 基于高通量單細胞測序解析心臟巨噬細胞調(diào)控心肌細胞增殖機制
3、探“云”指南 | 歐易云交互式火山圖——助你輕松找到“理想型”（上）
4、擊敗細胞通訊分析“攔路虎”，16問經(jīng)典答疑可收藏！
原創(chuàng)聲明：本文由歐易生物(OEBIOTECH)學(xué)術(shù)團隊報道，本文著作權(quán)歸文章作者所有。歡迎個人轉(zhuǎn)發(fā)及分享，未經(jīng)作者的允許禁止轉(zhuǎn)載。
