重磅：新型基因編輯工具PASTE，實現(xiàn)定點插入超大片段基因
2023-03-23 11:22 作者:ABclonal-愛博泰克 | 我要投稿
生命科學的飛速發(fā)展，為科學家自由操縱基因提供了前所未有的簡便和高效。在分子生物學實驗室里，你可以很方便地通過聚合酶鏈式反應（PCR）將一個基因克隆下來，并連接到相應的表達載體（質(zhì)粒）上。
遺憾的是，上述的分子克隆實驗通常是在原核生物中進行的（例如細菌），但涉及真核生物基因組的操作，特別是幾千個核苷酸長度的DNA序列的整合，仍然十分具有挑戰(zhàn)性。這也限制了合成生物學、細胞工程和基因治療等新興領(lǐng)域的發(fā)展。
CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，是由Cas9酶（負責切割DNA雙鏈）和gRNA（負責識別和靶向目標基因組特定位點）組成，gRNA引導Cas9到達基因組的特定位點并指導Cas9切割DNA雙鏈。當Cas9和靶向致病基因的gRNA被遞送到細胞中時，會切割致病基因的特定位點，造成DNA雙鏈斷裂（DSB），細胞隨后啟動DNA修復過程，但這種修復過程會出現(xiàn)錯誤，從而實現(xiàn)對致病基因的敲除。
該研究調(diào)的希望能開發(fā)出一種新工具，能夠在不不引起DNA雙鏈斷裂的情況下，去除并替換有缺陷的基因。為了實現(xiàn)這一目標，他們將目光放在了整合酶上，這是一類來自病毒（噬菌體）的酶家族，噬菌體利用整合酶將自己的基因組插入到宿主細菌基因組中。
在這項研究中，研究團隊專注于絲氨酸整合酶，它可以插入大片段DNA序列，最長可達5萬個堿基對。這些整合酶的目標是被稱為附著位點的特定基因組序列，它起著“著陸墊”的作用。當整合酶在宿主基因組中找到正確的附著位點時，就會與之結(jié)合，然后將攜帶的DNA片段整合進去。
PASTE技術(shù)原理
注：Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements（基于位點特異性靶向元件的可編程添加），簡稱PASTE，PASTE這個詞本身有粘貼、插入的意思。
Jonathan Gootenberg 表示，這項研究是實現(xiàn)可編程的DNA大片段插入夢想的一大步，通過這一技術(shù)可以很容易地根據(jù)需要定制附著位點和整合DNA片段。
從上述技術(shù)原理來看，PASTE很容易讓人想到劉如謙團隊開發(fā)的先導編輯（Prime Editor），在先導編輯的Cas9切口酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的基礎(chǔ)上融合了絲氨酸整合酶，相當于使用先導編輯先在基因組中插入絲氨酸整合酶的附著位點，然后通過絲氨酸整合酶來插入大片段DNA。
劉如謙團隊開發(fā)了升級版的先導編輯（Prime Editor），將其命名為——雙先導編輯（Twin Prime Editing，TwinPE）。TwinPE同樣不會導致DNA雙鏈斷裂，通過一個先導編輯蛋白（prime editor protein）和兩個向?qū)NA（pegRNA），可實現(xiàn)對人類基因組的可編程的大片段DNA的刪除、替換、整合和倒位。
在這項研究中，研究團隊使用PASTE技術(shù)將DNA片段插入了包括肝細胞、T細胞和淋巴母細胞等人類細胞中，研究團隊測試了13個不同的DNA片段，其中包括一些具有治療意義的基因，能夠?qū)⑺鼈儾迦氲交蚪M中的9個不同位點。
在這項研究中，研究團隊最長插入了36000個堿基對的DNA序列，但他們表示還可以更長。人類基因的堿基對從幾百個到200多萬個不等，但在治療中只需要使用其中編碼蛋白質(zhì)的序列，也就是外顯子序列即可，這大大減少了所需插入的DNA片段的大小。
2022年10月，弧光研究所（Arc Institute）的 Patrick Hsu 團隊在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Systematic discovery of recombinases for efficient integration of large DNA sequences into the human genome 的研究論文【5】。該研究開發(fā)了一種算法識別了數(shù)千種絲氨酸整合酶及其DNA附著位點，將已知絲氨酸整合酶的多樣性擴大了100倍。這些整合酶可以將超過7kb的大型DNA片段精準、高效地插入人類基因組。
大量識別新的絲氨酸整合酶及其附著位點是利用整合酶進行大片段DNA插入的一種思路，但是絕大部分的絲氨酸整合酶對人類細胞而言是有毒的，這就導致了發(fā)現(xiàn)的大部分新的絲氨酸整合酶是不可用的。因此，人為向基因組導入附著位點的方式，能夠幾乎在基因組的任何位置利用絲氨酸整合酶插入大片段DNA。
據(jù)悉，Omar Abudayyeh、Jonathan Gootenberg 于2021年創(chuàng)立了一家名為 Tome Biosciences 的生物技術(shù)公司。研究團隊正在進一步探索使用PASTE技術(shù)來替換有缺陷的囊性纖維化基因的可行性，此外，該技術(shù)可以用于治療許多由基因突變引起的疾病，例如血友病、G6PD缺乏癥、亨廷頓舞蹈癥等等。
對于大片段DNA的插入或替換而言，CRSIPR-Cas9可能并不是很好的工具，自然界中大量的可移動遺傳元件，能夠從中不斷發(fā)現(xiàn)有趣、有用的新工具，是未來值得探索的方向。
