Q1. shRNAx2.0 基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒推薦脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染還是電轉(zhuǎn)染？

shRNAx2.0基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒主要組分是DNA和SSR位點特異性重組酶，同時適用于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電轉(zhuǎn)染?？梢愿鶕?jù)不同的細(xì)胞類型選擇合適的轉(zhuǎn)染參數(shù)，一般貼壁細(xì)胞同時適用于兩種轉(zhuǎn)染方式，懸浮細(xì)胞建議采用電轉(zhuǎn)染。

Q2. 不同細(xì)胞系如何優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)？shRNAx2.0 基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒包含表達GFP的隨機shRNA序列質(zhì)粒，您可以根據(jù)試劑盒操作說明進行轉(zhuǎn)染測試，如果轉(zhuǎn)染后48h熒光率大于50%，說明轉(zhuǎn)染效果良好。如果熒光率不理想，可以按照轉(zhuǎn)染試劑的推薦優(yōu)化方案，使用GFP對照質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染參數(shù)摸索。對于一些較難用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如懸浮細(xì)胞，我們推薦電轉(zhuǎn)染。

Q3. 通過shRNAx2.0?基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒獲得的是瞬轉(zhuǎn)干擾還是穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾，如何獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細(xì)胞株？

通過shRNAx2.0干擾試劑盒構(gòu)建的細(xì)胞株是屬于穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細(xì)胞株。而且可以puro藥篩獲得長期穩(wěn)定的干擾細(xì)胞株，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的shRNA片段（shRNA載體攜帶puro和GFP）由于是穩(wěn)定插入目的細(xì)胞基因組，可以保證長期穩(wěn)定，只需要通過一周藥篩選，就可以通過Q-PCR鑒定進一步確認(rèn)所獲得的"干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株"的干擾效率。獲得其中干擾效率最高的細(xì)胞株進行擴增，為了維持干擾的效果，可以使用低濃度篩選藥物進行擴增培養(yǎng)。（擴增的藥物濃度可以是篩選藥物濃度的一半左右，具體按細(xì)胞的情況決定）

Q4. shRNAx2.0?基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒的原理是什么？為什么shRNA片段可以高效整合到基因組？

shRNAx2.0 基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒是基于SSR位點特異性重組酶技術(shù)。SSR重組酶會識別shRNAx2.0載體的骨架中的特定序列，并將該片段從載體中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的基因組中，由于SSR重組酶的效率極高，細(xì)胞基因內(nèi)可以獲得穩(wěn)定整合的拷貝數(shù)達到10~100個。在細(xì)胞基因組整合后，再通過藥物篩選的方式可以去除WT細(xì)胞，并將目的shRNA的表達上調(diào)到很高的水平，從而大幅提升對目的基因的干擾細(xì)胞。

Q5. shRNAx2.0?基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒的優(yōu)勢是什么？

shRNAx2.0 基因敲除試劑盒包含2個gRNA載體、1個對照shRNA、1管SSR重組酶。shRNAx2.0載體中的抗性標(biāo)記大大提高了篩選效率，并保證所有的細(xì)胞都可以有高拷貝表達shRNA片段，并且對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞都有效，可以實現(xiàn)大多數(shù)敲除細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)，干擾效率和操作與siRNA接近，但可以達到與病毒一致的穩(wěn)定干擾效果。

Q6.?shRNAx2.0基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒實驗周期多久？

按照正常的實驗周期，僅需一周時間，就可以獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細(xì)胞株，但是由于不同的細(xì)胞的增殖速度差異和藥篩敏感性差異，時間應(yīng)該在1~2周都能夠拿到穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細(xì)胞株。

Q7. shRNAx2.0?基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒的實驗是否需要進行單克?。?/strong>

按照正常的推薦，獲得的干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是不需要進行單克隆的。但是如果有這個實驗需求，我們建議使用極限稀釋方式，進行單克隆工作。

Q8. shRNAx2.0 基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒是否判斷有干擾的活性？

不同的干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株在干擾效果上面會有差異，所以不同的細(xì)胞株的干擾效果差異主要是由于轉(zhuǎn)染方式和轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率差異引起的，所以使用對照載體進行驗證非常重要，能夠保證目的細(xì)胞的GFP表達效率高于50%是試劑盒能夠高效起作用的基礎(chǔ)，但是最低也不能低于25%的轉(zhuǎn)染率。如果測試的時候不能確定細(xì)胞株是否符合脂質(zhì)體和電轉(zhuǎn)儀的測試結(jié)果，建議先使用對照質(zhì)粒進行驗證后再進行基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)實驗。所有GFP超過50%的細(xì)胞株都能夠保證可以Q-PCR干擾效率在50~90%的效果的干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細(xì)胞基因編輯

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