100 多年前，科學(xué)家 Thomas Hunt Morgan 從翅膀有 “notches” （即缺口） 的突變果蠅中鑒定出 Notch 基因，而后，這條進化上高度保守的信號通路逐漸被挖掘，這么保守又不失個性的信號通路，科研人，上套路！ 圖片

　　近期，Cell 刊登了清華大學(xué)施一公課題組大作：Structural basis of γ-secretase inhibition and modulation by small molecule drugs，該文闡述了 γ-分泌酶結(jié)合三種小分子抑制劑 （GSI） 和一種調(diào)節(jié)劑 （GSM） 的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并首次展現(xiàn)了 γ-分泌酶結(jié)合底物與藥物的過程。

　　提到大名鼎鼎的 γ-分泌酶，肯定有小伙伴搶答“它是淀粉樣蛋白前體蛋白 （APP） 的切割酶，與阿爾茨海默癥有關(guān)”，但是今天，我們要說的是 γ-分泌酶的另一重身份——Notch 通路激活的重要切割酶。

　　Notch 信號通路是一條在進化中高度保守的，決定細(xì)胞命運的重要信號通路之一。

　　別具一格的NOTCH

　　大多經(jīng)典的信號通路 （如 RTK 信號通路） 遵循“信號-受體-信號轉(zhuǎn)導(dǎo) （產(chǎn)生二次信使）-細(xì)胞核-轉(zhuǎn)錄”的信號級聯(lián)放大模式，而 Notch 通路則不按照這個套路出牌：Notch 受體與鄰近細(xì)胞的配體相互作用介導(dǎo)短時通訊，從細(xì)胞表面到細(xì)胞核基因組的信號是直接的，線性的，沒有信號級聯(lián)放大的過程。

　　

　　圖 1. Notch 信號通路

　　經(jīng)典信號通路中，細(xì)胞膜上的受體就像信號接收器，接受外源信號，繼而發(fā)生下游級聯(lián)放大反應(yīng)，其配體可源于細(xì)胞外基質(zhì)。而 Notch 信號通路的激活至少需要兩個細(xì)胞，發(fā)生細(xì)胞之間的直接“對接”，細(xì)胞 A 提供配體，細(xì)胞 B 提供受體，是一種獨特的依賴蛋白酶切的信號傳導(dǎo)模式。

　　Notch 通路的著名“三剪”

　　Notch 通路由四部分組成：Notch 受體?（Notch1/2/3/4），Notch 配體?（Delta-like ligands, DLL1/3/4；Jagged ligands, JAG1/2），CSL-DNA 結(jié)合蛋白，下游靶基因?（Hes 家族，MYC 等）。以上 4 個因素，任何一個因素改變都會對 Notch 信號傳遞產(chǎn)生影響。

　　Notch 的受體和配體都是膜蛋白，Notch 受體與配體結(jié)合后，經(jīng)過酶切，把有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的 Notch 蛋白片段 （NICD 或 ICN） 釋放出來，再與轉(zhuǎn)錄因子 CSL 結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因表達。

　　

　　圖 2. Notch 信號通路激活示意圖[2][3]

　　行走江湖，Notch 有著名“三剪”。

　　一剪 Notch 現(xiàn)形：Notch 以無活性的單肽前體形式在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，此時的未成熟蛋白包括 Notch 膜外受體部分，跨膜區(qū)域以及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 NICD 三個部分。Notch 初始蛋白被合成之后，轉(zhuǎn)運至細(xì)胞高爾基體內(nèi)，被高爾基體網(wǎng)絡(luò)中的 Furin 轉(zhuǎn)化酶蛋白水解切割，經(jīng)過第一次酶切 （S1 cleavage） 后形成異二聚體形式的成熟 Notch 受體并轉(zhuǎn)運至細(xì)胞表面。

　　二剪內(nèi)外殊途：細(xì)胞膜上成熟 Notch 異二聚體的胞外結(jié)構(gòu)域與其他細(xì)胞的配體結(jié)合，受體配體結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化，在 ADAM 金屬蛋白酶 （ADAM10 或 ADAM17/TACE） 切割的作用下發(fā)生第二次酶切 （S2 cleavage），此刻受體膜外部分完全被切掉。（這難道就是傳說中的“一剪沒”？

　　三剪“成就” Notch：第二次酶切后剩余的其他部分，被 γ-分泌酶進行關(guān)鍵性的最后一切 （S3 cleavage），形成可溶性 NICD 入核。

　　NICD 進入細(xì)胞核后，與 CSL 等轉(zhuǎn)錄蛋白結(jié)合，將原本“協(xié)同抑制復(fù)合物”轉(zhuǎn)換為“協(xié)同活化復(fù)合物”，進而與 DNA 形成多蛋白-DNA 復(fù)合體，激活下游相關(guān)基因的表達。

　　Notch 信號通路機制就是這么簡單，那么在實驗中是怎樣研究 Notch 通路的呢？

　　Notch 通路的基礎(chǔ)研究“小套路”

　　不像其他通路 （如 RTK、MAPK 等），Notch 通路沒有磷酸化之類的指標(biāo)可以檢測。在文獻里面最直觀的實驗手段就是使用 siRNA、shRNA 特異性沉默 Notch 蛋白，或者使用小分子抑制劑，如 γ-分泌酶抑制劑 （GSI）。

　　以 Li Yi 等人的 Notch 相關(guān)研究文獻 （PMID: 31382985） 為例，作者團隊通過不同實驗方法驗證了神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞 （GICs） 中完整的 Notch1-CXCR4-PI3K 信號通路，證明了 Notch1 通過調(diào)節(jié)趨化因子系統(tǒng) CXCL12/CXCR4，促進膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的侵襲、自我更新和生長。

　　

　　圖 3. Li Yi 等人驗證 Notch 與 CXCR4 相關(guān)通路的實驗思路圖

　　■ RNA 沉默 （siRNA 與 shRNA）

　　該團隊首先通過磁珠分選 （MACS） 的方法，富集 U87 和 U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的 CD133+ （腫瘤起始細(xì)胞標(biāo)記物） 細(xì)胞。CD133+ 膠質(zhì)瘤細(xì)胞球中表現(xiàn)出高的 Notch1 活性 （圖 4a，橘紅色熒光）。同時，免疫熒光結(jié)果顯示，與 CD133+ 膠質(zhì)瘤細(xì)胞球中，Notch1 陽性膠質(zhì)瘤細(xì)胞占很大比例，CXCR4 陽性膠質(zhì)瘤細(xì)胞僅占 CD133+ 膠質(zhì)瘤細(xì)胞球團的一小部分。但是，這些 CXCR4 與 Notch1 熒光染色共定位于球體的周圍 （圖 4b 黃色熒光共定位）。

　　

　　圖 4. a. CD133 和 Nestin 的免疫熒光染色確定 GICs 表型；b. GICs 腫瘤球中 Notch1 和 CXCR4 的共定位免疫熒光染色確定蛋白互作關(guān)系

　　為進一步研究 Notch1 在 GICs 中發(fā)揮的作用，作者團隊建立了穩(wěn)定的 Notch1 敲降神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞系 （U87-GIC/U251-GIC shNotch1）。如圖 5a 所示，shNotch1 細(xì)胞系中 Notch1 信號通路蛋白 （Notch1, Hes1） 低表達，CXCR4 表達顯著下調(diào)。并且shNotch1 組中 Notch1 的下調(diào)可以顯著抑制 GICs 的自我更新、侵襲和遷移，如圖 5b-d。

　　

　　圖 5. a. 建立穩(wěn)定的 shNotch1 細(xì)胞系；b. 腫瘤球形成實驗；c-d. 腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移實驗

　　■ 使用小分子抑制劑

　　γ-分泌酶抑制劑是最早發(fā)現(xiàn)和最大的一類 Notch 通路靶向藥物，能阻止 Notch 受體的第 3 次酶切，從而阻止 NICD 的釋放。

　　前面提到，Notch1 影響 GICs 的自我更新和生長，為進一步證明這一機制，作者團隊使用了 γ-分泌酶抑制劑 MK0752 來抑制 Notch1 途徑。MK0752 劑量依賴性降低了活化的 Notch1 （NICD） 的蛋白表達。同時在 U87/U251GICs 中，Notch1 通路被 shRNA 或 MK0752 下調(diào)，CXCR4 的表達以及 AKT 和 mTOR 的磷酸化水平也被顯著抑制。

　　

　　圖 6. 在 U87GICs 和 U251GICs 中驗證 Notch1-CXCR4-AKT/mTOR 通路

　　此外，Norihiko Saito 等人證明了 GICs 對 γ-分泌酶抑制劑敏感程度并不相同 （PMID: 24038660）。根據(jù) GICs 對 γ-分泌酶抑制劑給藥的反應(yīng)分為 Responder 和 Non-Responder 組。Responder 組中，Notch1、Notch1 NICD 和 Notch1 下游相關(guān)蛋白 （包括 Hes1、Hes3 和 Hes5） 均高表達，在 Non-Responder 組中則不然。γ-分泌酶抑制劑 DAPT 以劑量依賴性方式抑制 NICD、Hes1、Hes3 和 Hes5 的表達，而 Notch1 的表達沒有改變。同樣都是神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源細(xì)胞，但這兩組細(xì)胞對 DAPT 的響應(yīng)并不相同。

　　

　　圖 7. DAPT 對不同細(xì)胞系的 Notch1 相關(guān)蛋白的影響[5]

　　總結(jié)：

　　1、Notch 信號通路是線性的信號通路。

　　2、Notch 信號通路激活后的檢測，通常是檢測通路被激活后的 NICD 或者下游一些靶基因。本文轉(zhuǎn)載自：http://www.activeinhibitor.com/xw/828.html

　　3、針對 Notch 信號通路的抑制劑，最主要的一大類是 γ-分泌酶抑制劑，但是并不是所有的細(xì)胞系都對抑制劑高度敏感，要結(jié)合文獻選擇抑制劑。

　　Notch 通路的相關(guān)抑制劑

　　γ-分泌酶 （γ-secretase） 抑制劑 （GSI）

　　DAPT

　　具有口服活性的 γ-secretase 抑制劑，具有神經(jīng)保護活性，并可用于自身免疫性和淋巴增生性疾病，退化性疾病和癌癥的研究。

　　YO-01027

　　二肽類 γ-secretase 抑制劑，裂解 Notch 和 APPL 的 IC50 分別為 2.92 nM 和 2.64 nM。

　　BMS 299897

　　有效的 γ-分泌酶抑制劑，抑制 β-淀粉樣前體蛋白裂解的選擇性比 Notch 裂解更高。

　　LY-411575

　　γ-分泌酶抑制劑，能夠抑制 Aβ40 蛋白的產(chǎn)生，同時抑制 Notch 分裂。

　　靶向 Notch 轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的抑制劑

　　IMR-1

　　Notch 抑制劑，阻止 Maml1 募集到染色質(zhì)上的 Notch 三元復(fù)合體 （NTC），抑制 Notch 靶基因轉(zhuǎn)錄。

　　IMR-1A

　　Notch 抑制劑，IMR-1 的酸代謝物，相對于 IMR-1 的效力增加。

　　CB-103

　　靶向 NOTCH 轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，具有抗腫瘤活性。

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