來(lái)源??TMR Publishing Group

? 作者??Traditional Medicine Research 編輯部??

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研究亮點(diǎn)

兩個(gè)新的環(huán)肽化合物三棱素B和三棱素C被發(fā)現(xiàn)具有抗血瘀作用。本研究基于三元二次回歸正交組合設(shè)計(jì)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，首次提出一種用以準(zhǔn)確有效地預(yù)測(cè)藥物組合的綜合模式。

研究背景

血瘀癥（BSS）是中醫(yī)最重要的病理狀態(tài)之一。近來(lái)，BSS與微循環(huán)障礙和血栓形成密切相關(guān)。臨床研究表明，由血瘀引起的血栓閉塞患者患心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)很高。因此，從抗凝的角度改善BSS的治療方法至關(guān)重要。

三棱有九百年的藥用歷史，最早用于治療血瘀。在早期研究的基礎(chǔ)上，從三棱中分離出三棱素A（SA）、三棱素B（SB）、三棱素C（SC）如圖一。據(jù)報(bào)道，SA能改善血液狀況。然而，SB和SC的藥理作用尚不清楚。因此，為開(kāi)發(fā)新的臨床應(yīng)用藥物，探索SB和SC的作用勢(shì)在必行。血栓的形成涉及復(fù)雜的靶點(diǎn)，一個(gè)具有多組分、多靶點(diǎn)和多途徑特征的處方可能比單一藥物和單一靶點(diǎn)更能有效地緩解BSS。

本研究旨在利用三因素二次回歸正交組合設(shè)計(jì)優(yōu)化小鼠血瘀模型，探討SA、SB和SC的藥效。由于SA、SA和SC緩解BSS的作用機(jī)制尚不明確，故通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究了三棱素的作用機(jī)制及其關(guān)鍵靶點(diǎn)。

研究方法

造模：除了對(duì)照組，其余組的小鼠皮下注射鹽酸腎上腺素（1毫升/千克）。2 h后，小鼠在冰冷的水中（0℃）浸泡5分鐘，然后皮下注射鹽酸腎上腺素，2 h后重復(fù)這些步驟。通過(guò)自動(dòng)血液流變學(xué)分析儀測(cè)定血液粘度，判斷模型構(gòu)建是否成功。

單一因素實(shí)驗(yàn)：雌性昆明小鼠按照隨機(jī)分組分為9組，每組8只小鼠。對(duì)照組和模型組灌胃給予0.1%羧甲基纖維素鈉（0.1毫升/10克）。據(jù)報(bào)道，用作陽(yáng)性藥物的SA已知可以改善血瘀狀態(tài)。SA組是臨床藥物的6倍。SB組和SC組按不同劑量組給藥，分別為臨床劑量的2、4和8倍。臨床用藥一次60 μg/kg。每天一次，持續(xù)七天。給藥第6天，按照上述方法建立急性BSS模型（圖2）。第7天給藥后2小時(shí)，注射戊巴比妥鈉（55毫克/千克）麻醉小鼠。在離心管中取血，離心10分鐘（4 ℃，3000?× g），取上層血清，用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血栓素B2（TXB2）、纖維蛋白原（FIB）、組織纖維酶原抑制劑1（PAI1）和機(jī)體內(nèi)皮素（ET1）濃度。待小鼠處死后，采集胸腺、脾臟和肝臟，記錄器官重量，記錄胸腺指數(shù)（TI）、脾臟指數(shù)（SI）、肝臟指數(shù)（HI）和小鼠體重（g）。

三元二次回歸正交組合設(shè)計(jì)：根據(jù)單一因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)了三個(gè)因素五水平的正交實(shí)驗(yàn)，共計(jì)16組。每組8只小鼠，每天一次，持續(xù)7天。第6天按上述建模方法建立BSS模型，第7天處死小鼠檢測(cè)TI、SI、HI、TXB2、ET-1、PAI-1、FIB。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)：（1）SA，SB和SC治療血瘀證的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)：利用SwissTargetPrediction?（http://www.swisstargetprediction.ch/）獲取SA，SB和SC相關(guān)靶點(diǎn)，KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes resource（https://www.kegg.jp/）獲取BSS靶點(diǎn)。將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)上傳至在線韋恩圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）進(jìn)行映射得到SA，SB和SC治療血瘀證的潛在作用靶點(diǎn)。

（2）PPI 網(wǎng)絡(luò)和的藥物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建：將篩選出的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置連接評(píng)分（Combined score）?最小值為 0．4，并借助Cytoscape 3.7.1構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)利用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-通路圖。

結(jié)果

用流變儀檢測(cè)對(duì)照組和模型組的全血粘度，結(jié)果顯示模型組的全血粘度高于對(duì)照組（P < 0.01），表明BSS模型建立成功。從圖3A-C可以推斷，在SA、SB和SC治療后，HI呈下降趨勢(shì)，而SI和TI呈上升趨勢(shì)，并呈劑量依賴性。如圖3D-G所示，與模型組相比，給藥組的TXB2、ET-1、PAI-1、FIB水平均有所下降，且大部分存在顯著性差異（P < 0.05）。上述結(jié)果表明，SA、SB和SC能緩解微循環(huán)障礙和血栓形成。

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TQROCD設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：對(duì)于所建立的模型進(jìn)行了預(yù)測(cè)及方差分析（見(jiàn)表1-3），其回歸方程為V=10.648 ? 15.546A ? 0.862B + 18.340C + 70.244A × B ? 33.075B × C?26.430A × C + 43.514A^2 ? 36.300B^2 ? 29.176C^2。模型回歸方程R的相關(guān)系數(shù)為0.939，證實(shí)了三個(gè)因素的各水平與響應(yīng)值呈正相關(guān)。根據(jù)三種三棱素的實(shí)際劑量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SA、SB和SC的最佳劑量比為0.2982：0.1438：0.0417。

三棱素的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果：通過(guò)在線韋恩圖得到SA，SB和SC治療BSS的潛在作用靶點(diǎn)16 個(gè)。對(duì)16個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，如圖B所示。藥物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)如圖3所示血小板活化、流體剪切應(yīng)力動(dòng)脈粥樣硬化和補(bǔ)體凝血可能為SA，SB和SC治療BSS的主要通路，MMP9、PLG、SRC和AKT1靶點(diǎn)可能為SA，SB和SC治療BSS的主要靶點(diǎn)，提示SA、SB和SC能較好的治療BSS。

結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)，得出三棱素的最佳劑量比為A:B:C=0.298∶0.144∶0.042。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)推演出的4個(gè)可能靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)包括MMP9、PLG、SRC和AKT1，這些靶點(diǎn)可能是三棱素在BSS治療中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

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引用格式

Yu HZ, Cai JL, Ji SL, Xian MH, Liang SW, Wang SM. Optimization of synergistic drug combinations of different sparganins against blood stasis syndrome.?Tradit Med Res. 2021;6(6):52. doi:10.12032/TMR20210425229

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