科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)出一種基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的連續(xù)基因敲除細胞系技術(shù)，包括單個和多個（最多三個）靶基因插入和敲除，目的是進行細菌修飾。 CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種原核免疫。系統(tǒng)對外源遺傳元件（例如在質(zhì)粒和噬菌體中發(fā)現(xiàn)的那些）的抗性可以提供某種形式的獲得性免疫。具有間隔序列的RNA可以幫助Cas蛋白識別和切割外源DNA。 RNA引導(dǎo)的其他Cas蛋白可以切割外源RNA。在大約40％的細菌基因組序列和90％的古細菌序列中發(fā)現(xiàn)CRISPR。

通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)在基因敲除大腸桿菌中進行多次基因編輯

工業(yè)上有用的微生物的構(gòu)建需要有效的基因組規(guī)模的編輯工具。研究人員描述了一種靶向，連續(xù)的多基因編輯策略，該策略使用化膿鏈球菌II型CRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于大腸桿菌基因組，以實現(xiàn)多種精確的基因組修飾，包括基因刪除和插入，效率最高是100％，它可以同時在三個目標(biāo)上執(zhí)行多基因編輯。該系統(tǒng)還證明，它成功地在另一種Enterobacteriaceae-Tatumella citrea中實現(xiàn)了靶向染色體缺失，效率高達100％。

使用CRISPR / Cas9在大腸桿菌中進行多個逐步基因敲除

隨著最近使用CRISPR / Cas9技術(shù)作為基因組編輯的標(biāo)準(zhǔn)工具，世界各地的實驗室都經(jīng)歷了自PCR以來最大的分子生物學(xué)進展之一。該方法的主要優(yōu)點是它的簡單性和對任何類別的通用性。特別令人感興趣的是被廣泛研究的革蘭氏陰性細菌大腸桿菌，因為它被認為是研究和工業(yè)應(yīng)用的主要力量。研究人員提出了一種使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)與λRed機器相結(jié)合的簡單，可靠和有效的方案，用于在大腸桿菌中進行基因敲除。在我們的程序中，至關(guān)重要的是使用雙鏈供體DNA和一種固化策略來去除編碼RNA的引導(dǎo)質(zhì)粒，該質(zhì)粒允許僅在兩個工作日內(nèi)引發(fā)新的突變。我們的協(xié)議允許具有高誘變效率的多個逐步敲除菌株適用于高通量方法。

全基因組多功能CRISPR系統(tǒng)用于高通量基因型-表型作圖

由于我們對細胞網(wǎng)絡(luò)的了解有限，因此基因組規(guī)模的工程設(shè)計是了解基因組功能必不可少的工具。不幸的是，大多數(shù)現(xiàn)有的全基因組和基因型-的作圖方法僅限于基因組改變的單一模式，即過度表達，抑制或缺失。研究人員報告了一種通用的全基因組CRISPR（MAGIC）系統(tǒng)，該系統(tǒng)可將所需基因在整個基因組中的表達水平精確控制在所需水平。據(jù)我們所知，通過將三功能CRISPR系統(tǒng)與由陣列合成的寡核苷酸文庫結(jié)合，MAGIC被用于創(chuàng)建酵母中最全面和多樣性的基因組文庫之一。 MAGIC的能力通過鑒定以前未表征的復(fù)雜表型遺傳決定子來證明，尤其是當(dāng)擾動到不同表達水平時具有協(xié)同相互作用的決定子。 MAGIC代表了強大的合成生物學(xué)工具，可用于研究基本生物學(xué)問題并設(shè)計用于生物技術(shù)應(yīng)用的復(fù)雜表型。

Ubigene已開發(fā)出CRISPR-B?以優(yōu)化微生物基因編輯載體和工藝。效率和準(zhǔn)確性遠高于傳統(tǒng)方法。 CRISPR-B?可用于細菌和真菌的基因編輯。

Reference

Endo M, Mikami M, Toki S. Multigene knockout utilizing off-target mutations of the CRISPR/Cas9 system in rice. Plant Cell Physiol. 2015;56(1):41-47. doi:10.1093/***/pcu154

K?nig, Enrico & Zerbini, Francesca & Zanella, Ilaria & Fraccascia, Davide & Grandi, Guido. (2018). Multiple Stepwise Gene Knockout Using CRISPR/Cas9 in Escherichia coli. BIO-PROTOCOL. 7. 10.21769/BioProtoc.2688.

Jiazhang Lian, Carl Schultz, Mingfeng Cao, Mohammad HamediRad,Huimin Zhao.Multi-functional genome-wide CRISPR system for high throughput genotype–phenotype mapping.Nature Communications .2019.

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達的機制。

源井生物根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

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